可用于所有体外细胞培养系统 科学家开发谱系记录仪iTracer

近年来，诱导多能干细胞衍生的类器官，为研究人体器官发育提供了模型。据悉，单细胞转录组学能对这些系统中的细胞状态进行高度解析。然而，此前尚无方法去直接测量血统关系。

基于此，浙大校友何志嵩和同事们共同研发了谱系记录仪 iTracer，它能将报告条形码与可诱导的 CRISPR–Cas9 瘢痕相结合，并与单细胞和空间转录组学兼容，借此即可探索大脑类器官发育过程中的克隆性和谱系动力学。

详细来说，该记录仪允许从初始化 iPSC 池进行克隆追踪，同时还可以使用诱导性疤痕在不同时间点进行谱系记录，既可以进行克隆分析，也可以探索细胞命运建立的时间动态，规避了多轮诱导性疤痕标记的低效问题。

2021 年 12 月30日，相关论文以《人脑类器官中的谱系记录》(Lineage recording in human cerebral organoids)为题，发表在 Nature Methods 上[1]。

长期以来，何志嵩所在研究组对人类早期胚胎发育时中枢神经系统尤其是脑部发育、神经发育相关疾病的发病机理、以及发育时的表现有着浓厚兴趣。

研究中，他们使用大脑类器官微型三维组织培养技术，定向诱导人类胚胎干细胞，或诱导多能干细胞分化成不同类型的脑部神经元以及其他细胞类型，从而对人类脑部早期发育过程、进行模拟和机理研究。

为全面描绘这一过程中细胞分子特征的变化，他们大量使用单细胞测序技术、尤其是单细胞转录组技术，来获取期间可能出现的动态细胞状态，并通过整合不同时间点的样本数据、以及各种计算分析手段，来推测不同细胞类型的发生过程。

不过这一方法也有局限性，当前单细胞测序技术需要对细胞进行破坏式测量，因此只能获取细胞在最终测量时、关于细胞状态的单一快照。

这样既无法得知细胞的历史状态，更无法得到细胞的谱系信息，也就是说这些细胞系在特定时间由同一个干细胞分裂分化所产生的后代细胞。

而对于更好地描绘大脑早期发育过程，这些信息至关重要。为此，何志嵩和他的同事们需要一种新技术，在兼容当前单细胞测序技术的同时，可进一步获取细胞谱系信息，即进行细胞谱系追踪。

当前，可兼容单细胞转录组测序的细胞谱系追踪技术，主要分成两类：

一类为静态序列标记，即构建一个高复杂度的条码序列文库、转染并整合到干细胞中，从而标记不同的干细胞;

另一类为基于 CRISPR 技术的动态序列标记，即通过诱导 CRISPR 编辑系统，对一个特定序列引入一系列随机突变，并通过每个干细胞中检测到的突变组合，来构建细胞谱系信息。

这两种技术各有利弊：静态序列标记仅能获取单个时间点的谱系信息;而基于 CRISPR 技术的动态标记，则存在比较严重的标记冲突问题，多次独立编辑事件会产生同样的突变，从而导致重构谱系信息的不准确。

为更好地解决这一问题，何志嵩和他的同事一起整合了这两类技术，开发出 iTracer 技术。iTracer 包含静态序列标记原件，可用于标记起始时间点的不同干细胞，也包括基于 CRISPR 编辑系统的动态序列标记，结合带有可诱导 Cas9 蛋白基因的干细胞，即可在特定时间点产生额外的随机突变，从而得到第二层细胞谱系信息。

概括来说，该技术综合了两类已有技术的优点，既能获得多个时间点的谱系层次信息，也能降低标记冲突问题造成的影响。

随后，他们将 iTracer 技术用于大脑类器官系统中，借此研究大脑类器官中不同类型神经元之间的谱系关联。

他发现，代表不同脑区的神经元，倾向于由不同的多能干细胞产生，且同一多能干细胞产生的后代细胞，在空间分布上呈现出聚集分布的特征。

这一现象暗示着，在分裂分化过程中，大脑类器官的细胞并未发生显著的细胞迁移，因而其后代细胞呈聚集分布，并在类似的微环境作用下，被诱导为同样类型的神经元。

通过使用长时间光片显微镜技术，对稀疏核标记的大脑类器官进行追踪观察，这一假设也得到了进一步证明。

而在此基础上，通过在不同时间点引入动态序列标记，还可得到大脑类器官中不同细胞类型、特别是不同类型神经元的命运决定关键时间点，并对同一多能干细胞产生的不同后代神经元的分化情况进行比较。

此外，通过在 iTracer 的基础上额外引入一个针对靶点基因的 gRNA，还能在利用 iTracer 记录细胞谱系信息的同时，对靶点基因进行基于 CRISPR 技术的基因敲除，并据此对基因敲除如何影响细胞谱系的发展分化进行研究。

据介绍，何志嵩和同事们也将 iTracer-perturb 这一技术用于大脑类器官中，并就 TSC2 基因对大脑类器官中神经元发育的影响，进行了初步探讨。

结合基于CRISPR技术基因敲除的iTracer技术

该研究始于 2017 年。何志嵩所在小组主要关注的生物系统，一般和组织发育、组织再生、干细胞分化等相关，其中包含大量细胞状态的动态转换。

因此，彼时已逐渐成熟的大规模单细胞转录组测序技术，让他得以研究这些动态过程。但是，受限于单细胞测序技术对所测量细胞的破坏性，如何通过实验手段直接获得不同细胞之间的谱系发生关系，成为何志嵩和他的同事们迫切希望解决的问题。

当时，包括华盛顿大学遗传学和发育生物学系教授萨姆·莫里斯(Sam Morris)团队的静态序列标记技术 CellTag，以及德国柏林医学系统生物学研究所(BIMSB)扬·菲利普·容克(Jan Philipp Junker)团队的动态序列标记技术 LINNAEUS 等刚刚出现。

它们都是可兼容单细胞转录组测序技术的细胞谱系追踪技术，何志嵩所在的研究团队也开始进行使用。但在随后，他们很快就发现了上述技术的局限性，因此想开发一种能将静态序列标记和动态序列标记结合的方法。

这一想法变成课题并于 2018 年正式开始，他们先是构建了包含 iTracer 元件的转座子质粒载体，并开始在大脑类器官中利用 bulk 测序论证 iTracer 技术的可行性。

在确定技术可行后，在 2019 年起他们将 iTracer 技术用于大脑类器官系统中，借此获得了在不同时间点进行动态序列标记诱导的大脑类器官单细胞转录组测序数据，并进行数据分析。

2020 年初，迎来数据分析的初步结果。何志嵩借此得知，多能干细胞在分裂分化、以及产生大脑类器官的过程中，并未发生明显迁移。基于此，他做出了同一谱系的细胞在空间中出现聚集的假设。

为证明该假设的合理性，一方面他和研究组的其他成员一起结合 iTracer 技术与空间转录组，去观察不同细胞谱系在大脑类器官中的分布;另一方面他们还使用长时间光片显微镜技术，对大脑类器官的早期发育进行记录，并对其中数个被进行细胞核标记的干细胞、及其后代细胞进行追踪。

这两个方法均验证了上述假设。然后，通过比较在不同时间点引入动态序列标记的样本，何志嵩对大脑类器官中、不同神经元的“命运发生”重要时间节点做以推断，并通过产生对应时间的大脑类器官的单细胞转录组数据，确认了在该时间点中不同神经祖细胞的存在。

考虑到此次使用的 10x Genomics 的单细胞测序技术，实际上只测量了每个大脑类器官中的极个别细胞，这导致每个细胞谱系只能获得少数几个细胞的数据，也给谱系之间的直接比较带来困难。

为此，研究团队还对单个类器官进行显微切割，并对所得到的各个部分，分别进行了深度的单细胞转录组测序，从而实现了对细胞谱系的充分取样。

最后，他们又对 iTracer 技术做了拓展，在原来 iTracer 载体的基础上再引入一个靶向目标敲除基因的 gRNA，从而将它和基于 CRISPR 技术的基因敲除结合起来。

这让他们对所得到的 iTracer-perturb 技术进行了初步应用，并对 TSC2 基因在大脑类器官发育过程中的作用、以及对细胞谱系的潜在影响进行了研究。

(来源：Nature Methods)

可用于所有体外细胞培养系统

研究中还曾发生过一个小插曲，何志嵩表示：“对于不同神经元富集不同多能干细胞谱系的这个结果，一开始让人很是始料未及。因为我们认为，用于培养大脑类器官的多能干细胞是均一的，所以很自然地觉得，不同干细胞会以均等的可能性，产生各种神经元。”

因此，当时他的第一反应是分析方法可能有问题，或由于某些原因导致不同干细胞，确实存在产生不同神经元的倾向性。

直到在一次讨论中，他才突然意识到其实这个结果完全可能用干细胞低迁移性导致的细胞谱系非均匀分布，以及不同神经元的空间非均匀分布来解释。

为进一步确认该想法，他又设计了 iTracer 与空间转录组学的结合、以及长时间光片显微镜的实验，而这些实验又确确实实地证实了上述想法。

对于潜在应用，他表示：目前该技术的应用，应该会停留在基础研究领域，但绝不局限于大脑类器官这一个系统。理论来看，iTracer 技术可用于所有体外细胞培养系统，唯一要求是所使用的干细胞必须带有可诱导的 CRISPR 编辑系统。”

生于广东，本科就读于浙大生命学院

何志嵩是广东中山人，生于 1987 年。本科就读于浙江大学生命科学学院生物信息学专业，2009 年保送至当时的中科院上海生命科学研究院的马普学会-中科院计算生物学伙伴研究所，师从菲利普·海托维奇(Philipp Khaitovich)研究员。

2015 年博士毕业后，他继续留组研究至 2017 年。在中科院期间，何志嵩以第一作者或通讯作者身份在 Nature Neuroscience、Molecular Psychiatry 等期刊发表了数篇论文。

2018 年，他来到德国莱比锡马普学会进化人类学研究所，并加入芭芭拉·特鲁特林(Barbara Treutlein)教授的单细胞基因组学研究组，进行博后研究。

2019 年，他随团队搬到瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系，并继续在特鲁特林团队进行博后工作。

期间，何志嵩的研究方向是单细胞功能基因组学、特别是单细胞转录组学数据的分析及方法开发，并以大脑类器官及其他类器官系统作为模型，研究早期人类大脑和其他器官发育过程中细胞命运的决定机理。

来到瑞士后，他先后以一作或通讯作者身份在 Nature、Genome Biology 及Stem Cell Report 中发表论文。

2021 年 7 月份，何志嵩成为团队的高级研究助理，在做科研的基础上，开始负责计算资源管理、以及部分学生指导工作。

对于此次论文的后续研究，他表示：“我们正将 iTracer 技术用于组内的几个其他研究，并已取得不错的结果。同时，也希望对 iTracer 做进一步改进，主要会研究 CRISPR 系统引入动态序列标记的效率较低的问题。”

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关键词： 开发 科学家 谱系 科学