柴胡皂甙是一种常用的中药植物，柴胡皂甙(SSs)是柴胡中主要的活性齐墩果烷型三萜皂甙。β-香树脂醇合成酶（β-AS）是齐墩果烷型三萜皂苷合成中的重要酶类，但其在柴胡皂苷合成中的作用鲜有研究。

【资料图】

根据代谢组学和转录组学分析选择推定的β-AS基因BcBAS1被克隆，通过在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源表达进行功能表征,检查了其亚细胞定位和表达模式。BcBAS1重组蛋白的分子量约为87kDa，该蛋白可催化SSs前体β-香树素的产生。

此外，BcBAS1位于胞质溶胶中，四种基因型的四种组织中的相对表达与SSa和SSd含量呈正相关。我们的结果表明BcBAS1是一个β-AS基因，可能在柴胡皂苷的生物合成和调控中发挥重要作用。这项研究阐明了β-AS基因在SS合成中的作用，并为SS的代谢工程提供了见解。

三萜皂苷和三萜类化合物作为植物次生代谢产物，是许多植物中含量最丰富的天然产物。三萜类化合物的生物合成依赖于类异戊二烯途径(Mosesetal. 2014 )。三萜类化合物的生物合成始于2,3-氧化鲨烯和2,3-氧化鲨烯在氧化鲨烯环化酶(OSC)的催化下环化成不同形式的三萜骨架。

三萜骨架被细胞色素P450酶(P450s)羟基化或氧化，最后被尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)糖基化，从而产生不同的三萜皂苷。

OSCs被广泛认为在不同类型三萜皂苷的产生中起着至关重要的作用，它们也被定义为调节不同三萜皂苷合成的重要分支点。β-AS是OSC家族的成员，负责产生齐墩果酸皂苷骨架。

目前，超过1600条β-AS序列已在GenBank数据库中注册，其中许多已在许多植物物种中被克隆和功能表征（Maetal.2018b ）。然而，关于柴胡属植物中β-AS基因的研究很少。只有两个β-AS基因，称为bcAS1(Gaoetal. 2015 )和BcBAS(Lietal.2015)。2020 )，具有来自B.chinense DC.的完全克隆序列，BcBAS已在酿酒酵母中进一步表达以分析其功能。

此外，β-AS在不同基因型白蛉DC中的亚细胞定位和表达模式。目前还不清楚。因此，有必要研究β-AS基因在柴胡植物中的克隆、表征、亚细胞定位和表达模式。

在我们之前的研究中，通过代谢组和转录组的综合分析鉴定了24个β-ASunigenes。这24个β-ASunigenes可能代表了BLAST选择的四种非冗余β-AS（BcBAS1、BcBAS2、BcBAS3和BcBAS4），并且Bc61215(BcBAS1)与SSd和SSb显着相关。

在这项研究中，我们获得了BcBAS1的全长序列，并在大肠杆菌中表达了它。还研究了拟南芥叶原生质体中的亚细胞定位和使用毕赤酵母GS115中的异源表达系统推断的功能。

我们进一步探讨了BcBAS1在四种基因型中的表达模式，首次分析了该基因的表达量与SSs含量的相关性。结果表明，BcBAS1是β-AS基因，仅催化β-香树脂素的形成。BcBAS1可能是合成SS的关键酶，我们的研究可能为SS的代谢工程提供见解。

的植株材料为白蔹 DC.的4个基因型，即CBC1、CBC3、RX和FS。于2020年7月在盛花期采集，所有样品立即用液氮冷冻，并储存在-80°C直至进一步使用。

RNA分离、cDNA合成和基因克隆

从四种基因型的白蛉DC的不同组织中，提取总RNA ，根据制造商的说明使用RNAPrepPurePlantKit，对3株个体植物的混合样品进行每次RNA提取。

按照制造商的说明，使用一体式第一链cDNA合成SuperMix（TransScript，中国）从1000ng总RNA合成第一链cDNA，全长BcBAS1序列取自B.chinense DC。

转录组文库，包括来自四种不同组织（根、叶、茎和花），总共93486个unigenes（Heetal. 2021). 利用ORFFinder定位BcBAS1的开放阅读框（ORF），根据其全长序列，利用Primer5.0软件设计扩增BcBAS1的特异性引物。

为了进一步研究BcBAS1的生物学作用，我们分析了在拟南芥叶的原生质体中用绿色荧光蛋白(GFP)融合瞬时表达的BcBAS1的亚细胞定位，并通过共聚焦显微镜观察它们。

BcBAS1基因的融合表达载体是使用特异性引物对构建的，将该片段插入pBI221-GFP载体以生成pBI221-GFP-βAS融合蛋白。含有与红色荧光蛋白mCherryORF融合的拟南芥，H+-ATPase质膜信号蛋白片段的pBI221-PM-mCherry载体，被用作膜定位控制标记.，所有荧光图像，包括GFP和mCherry信号，均使用激光扫描共聚焦显微镜进行可视化。

GFP的激发和发射波长分别为488nm和510–550nm，mCherry的激发和发射波长分别为587nm和610–650nm。

序列和系统发育分析

为了了解BcBAS与其他植物OSC的进化关系，我们将它们的氨基酸序列与其他报道的具有已知功能的OSC的氨基酸序列进行了比较。

系统发育分析结果，根据它们的序列将这些基因分为第一组和第二组。BcBASs都聚集在第一组，即单功能β-AS基因组，β-香树素是主要化合物。第II组包含产生α-香树素和β-香树素的多功能酶，以及其他化合物，例如δ-香树素、羽扇豆醇、蒲公英甾醇、Ψ-蒲公英甾醇和达马烯二醇-II。

此外，BcBAS3与CrAS和OEA基因聚类，可产生α-香树脂素和β-香树脂素。BcBAS2与PNY1聚类最紧密，BcBAS4与AaBAS、TkASC6和AsOXA1归为一组，这些基因被表征为只能产生β-香树脂素的单功能β-ASs。BcBAS1与其他BcBAS不同；它聚集在组I中，但与其他组并不接近。这些结果表明BcBAS2和BcBAS4可能是单功能的β-ASs，

我们根据转录组序列设计特异性引物，得到的BcBAS1全长2498bp，ORF为2289bp，编码762个氨基酸的蛋白质，分子量约为87kDa，理论等电点(pI)为5.92。发现BcBAS1与β-ASs具有很高的相似性；它与B.chinense DC的β-AS具有98.60%的序列相似性。(HQ166837.1)与柴胡(AY514455.1)、胡萝卜中的β-AS具有97.86%、85.66%和84.00%的相似性。

此外，比对分析（图 2)中柴胡(Lietal. 2020 )、拟南芥(Kolesnikovaetal. 2007 )、人参(Kushiroetal. 1998 )和甘草(Hayashietal. 2001 )中BcBAS1氨基酸序列的保守区域显示BcBAS1表现出OSC基因的典型保守区域，与其他区域相似。

BcBAS1不仅包含DCTAE基序，被认为是底物结合基序，在真核OSC中高度保守，但也有一个MWCYCR基序,这是β-ASs的特征基序。此外，它拥有4个QW基序，可能在加强酶的结构和稳定其碳阳离子中间体方面发挥作用。

BcBAS1的亚细胞定位

蛋白质亚细胞定位的在线预测显示BcBAS1可能存在于胞质溶胶中。为了确认BcBAS1的预测定位，我们构建了一个pBI221-GFP-βAS载体，并在拟南芥原生质体中瞬时表达质粒，以及与mCherry融合的H+-ATPase蛋白。

原生质体边缘有明显的绿色荧光。BcBAS1-GFP信号与单独的GFP信号相似，没有与红色荧光蛋白mCherry信号重叠，表明BcBAS1确实是一个定位于胞质溶胶的基因，这与预测一致。

为表达BcBAS1融合蛋白，构建重组载体pET28a-βAS并测序验证。将重组载体pET28a-βAS转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG37℃诱导4小时，25℃诱导8小时，16℃诱导16小时。

SDS-PAGE分析显示，25°C8小时和16°C16小时导致融合蛋白成功表达，预期大小约为87kDa，这在阴性对照中未显示。重组蛋白以包涵体形式表达，16℃16h是融合蛋白诱导的最佳条件。

BcBAS1的表达分析

为了深入了解BcBAS1基因的表达模式，我们对B.chinense DC.的四种基因型进行了qRT-PCR，包括根、叶、花和茎四种组织。BcBAS1在4个基因型的所有组织中均有表达，其在根部的表达量显着高于4个基因型的其他组织，CBC1、CBC3和RX茎中的表达量最低，而花在FS中的表达水平最低。

BcBAS1转录水平在根中比在CBC3的茎中高121.7倍，而在RX、FS和CBC1中分别高92.3、53.6和12.6倍，分别。根中最高的转录水平表明根可能是柴胡皂苷合成的主要场所。B.chinense DC..此外，BcBAS1的表达水平和模式在四种基因型之间表现出较大差异，这可能是基因型本身差异的结果。

BcBAS1基因表达与柴胡皂苷含量的相关性

为了研究BcBAS1基因表达水平与SSs含量之间的关系(Heetal. 2021 )，使用IBMSPSSStatistics20.0进行了Pearson相关分析。BcBAS1的表达与4个基因型的SSa和SSd呈正相关。

并且与CBC3叶片中的SSa和SSd呈极显着正相关（p<0.01）。BcBAS1表达与FS叶片中的SSd也呈显着正相关（p<0.05），其他相关性无统计学意义（p<0.05）。

基于分析，我们推测BcBAS1基因的表达水平影响了SSs的含量。BcBAS1基因可能在SS的合成中发挥重要作用，BcBAS1基因表达的增加可能导致SS及其前体的产生增加。

结论

在这项研究中，一个名为BcBAS1的SSs通路基因来自B.chinense DC。使用异源表达系统在大肠杆菌 和巴斯德毕赤酵母中成功克隆和表征。

我们的结果表明，BcBAS1的重组蛋白大小约为87kDa。BcBAS1是β-AS基因，β-香树脂是毕赤酵母唯一的发酵产物表达BcBAS1。BcBAS1位于细胞质中，这与我们的预测一致。此外，BcBAS1的表达水平与SS的内容密切相关。四种基因型的根中BcBAS1表达水平最高，BcBAS1可能参与SSs的生物合成和调控。

然而，BcBAS1的功能还需要进一步探索，P450s和UTGs在SSs生物合成中的协同调节也需要在未来进行研究。该工作的结果进一步揭示了SSs的生物合成途径，可能有助于进一步研究SSs的生物合成和调控，为今后SSs的代谢工程奠定基础。

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