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引言

与半胱氨酸蛋白酶和胰蛋白酶不同，半胱氨酸组织蛋白酶缺乏严格特异性，用组织蛋白酶K、V、B、L、S和F对细胞裂解物进行蛋白质组学分析，鉴定出30,000个裂解位点，并通过sap - esi进行分析。

(资料图片)

sap - esi用于生成支持向量机器学习的聚类和训练集，对sars - cov - 2s蛋白的切割位点预测揭示了生理条件下最可能的首次切割。

组织蛋白酶V配合物中代表性肽的晶体结构分析显示，与sap - esi分析的蛋白质组学数据一致的刚性和柔性位点对应于残基分布不均匀和均匀的位置。

对靶向修饰蛋白质(如蛋白酶)的酶特别有益，半胱氨酸组织蛋白酶特别适合证明这种方法的潜力。

因为它们缺乏特异性口袋，这导致难以捉摸的特异性谱，使得预测它们在底物中的切割位点远不明显。

一、多肽基底物的异质和均质位置

在我们研究的实验部分中，用蛋白酶K、V、L、S、F和b分别处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞裂解物，用n端联合分数对角层析法(COFRADIC)测定这些组织蛋白酶的内蛋白水解活性的剪切位点。

为了确保排除内源性蛋白水解活性，我们使用了代谢标记(基于silac)，因此总是一个控制条件(细胞裂解液未与组织蛋白酶孵育)来进行比较。

分析的解理位点总数为29,674个，组织蛋白酶K、V、B、L、S、F各贡献了9583 ~ 3500个切割位点，分别属于3167种不同的蛋白质，其中1592种至少有部分结构存在于蛋白质结构数据库中。

所有组织蛋白酶的大多数切割发生在间隔一个残基的地方，与组织蛋白酶K, B, S和F相比，组织蛋白酶L和V在较长分离时间内切割数量的下降更为缓慢。

大多数裂解位点残基是表面可接近的(总数94%)，43%的裂解位于二级结构元件的外部。

独特切割是由一个或多个组织蛋白酶在多个位点切割的蛋白质上仅由一个组织蛋白酶(10,586或36%的切割)进行的切割，和单一的分裂是由单个组织蛋白酶在一个网站在一个给定的蛋白质(941或3%的分裂。

每个组织蛋白酶(行)从P15到P15′(列)位置残基分布正态性的p值用圆圈的大小表示。

红色和灰色圆圈分别表示p值等于或小于0.05(非正态)，大于0.05和等于1.00(正态)。

组织蛋白酶S和F的异质位置P9 "源于带正电残基的最大值，由于与裂解位点的距离，它们没有被纳入进一步的分析。

三次聚类准则(CCC)确定聚类数量，CCC值大于2.0表示确定的集群数量，CCC值在0.0和2.0之间对应较少的集群数量，CCC值为负值对应可能的异常值。

在聚类优化过程中，通过使用各种评分矩阵(BLOSUM62)、距离归一化和氨基酸包含位置(异构位置给出最佳结果)来优化距离计算。

第一次分支后，组织蛋白酶K、V、B、L、S和F的CCC值分别为11.8、6.69、12.0、9.7、11.6和4.51，当一个星团至少有一个位置具有可识别的模式时，它就是定义良好的。

组织蛋白酶标识符、簇号和簇中肽的数量显示在每个图的顶部，残基块根据其份额进行排序，背景颜色代表氨基酸残基的化学类型，(TPR)范围为0.802至0.848，准确度范围为80%至91%。

二、病毒蛋白组织蛋白酶裂解的预测

之前研究过组织蛋白酶对sars - cov - 2s蛋白的切割，但生理上相关的加工位点很可能只是在生理条件下进行的第一次切割。

SVM模型预测了SARS-CoV-2 S蛋白的大面积裂解，其中G700-A701是组织蛋白酶K、V、L、S和f最可能的裂解位点。

SDS-PAGE上分子量约为55和70 kDa的S蛋白片段带被怀疑是第一次组织蛋白酶切割的结果，并通过n端测序进行了分析。

组织蛋白酶建立的切割区域靠近furin切割位点(R685-S686)，远离TMPRSS2切割位点(R815-S816)，组织蛋白酶可能有助于S蛋白变异S1片段的产生。

S蛋白为三聚体，切割在单个原聚体中呈现白色(A链)，B链和C链分别为浅蓝色和浅绿色。S蛋白用MAIN生成，用RASTER 3D渲染。

质谱法提供了底物序列中裂解位置的数据，但这些数据并不能提供底物残基与蛋白酶亚位点特征相互作用的见解。

组织蛋白酶复合物的晶体结构与裂解底物的代表性肽。

组织蛋白酶V晶体的浸泡和共结晶得到21种组织蛋白酶V肽复合物的结构和28种独特的肽结合几何形状，其中26个以类似底物的方式与活性位点结合。

所有组织蛋白酶V复合物的晶体结构都是重叠的。

结合肽在组织蛋白酶V活性位点残基的背景上显示为灰色棒状，表面显示为半透明灰色。结合的肽显示为按(a) I(红色)，(b) II(紫色)，(c) III(蓝色)和(d) IV(紫色)模式着色的棒模型。

氯离子呈绿色球状，MPD分子呈深灰色棒状。这些图形是用MAIN(59)生成的，用RASTER 3D渲染的。

三、特定的相互作用使底物位置不均匀

P1和P2残基的氢键模式限制了它们侧链的位置，有利于P1残基的溶剂暴露和结合到P2残基的疏水口袋中。

组织蛋白酶V中P1 "位置的异质性可以通过带负电荷的D163残基与底物Arg侧链的正电荷之间的特定相互作用来解释。

与其他组织蛋白酶内肽酶的结构比较表明，组织蛋白酶V (D163)、L (D162)和F (D160)共享Asp，类似地共享的异质位置，这从V3、V5、V7、L4和F2簇中普遍存在的赖氨酸残基。

组织蛋白酶K (N161)和S (N163)在等效位置上具有中性Asn残基，它不能与底物的碱性残基如Arg和Lys进行离子相互作用，这反过来使它们的P1 "位置均匀。

活性位点(3IV2)中含有SO42-离子的C25A突变体由于活性位点扭曲，其结构未被包括在内。

通过Koshland诱导拟合模型提出蛋白质的动态性质，溶液中蛋白质柔韧模型进行扩展，表明酶采用不同的构象来适应不同的结合伙伴，适用于底物均匀位置残基的结合。

能够使用sap - esi的组织蛋白酶区域和残基，这些区域和残基赋予它们特定的性质。

药物发现项目和前药物偶联物中切割序列的直接应用具有潜在的相关性，在前药物偶联物中，选择性切割连接物是靶向药物递送的主要障碍之一。

蛋白质组学和结构见解结合起来提供了异质与均匀位置的概念，一方面指出了选择性位点和由簇指示的潜在模式组合的复杂性，另一方面提供了使用适量配体在蛋白酶活性位点内诱导构象变化的实验暴露。

阴性肽的数量比阳性肽的数量多1500个。随机预测线在和之间，真阳性率(TPR)或检测裂解的灵敏度或概率与假阳性率(FPR)的关系来绘制ROC图。

四、结论

蛋白质组学数据与结构分析相结合揭示了结构刚性和灵活性对半胱氨酸组织蛋白酶选择性的相互作用提供了重要洞见。

半胱氨酸组织蛋白酶是一类重要的酶，参与了许多生物过程和疾病的发展，通过蛋白质组学数据的大规模分析获取大量的结构信息和蛋白质互作网络。

揭示不同半胱氨酸组织蛋白酶的选择性，结构分析则帮助我们理解蛋白质的三维构象和动力学性质。

结构刚性和灵活性是半胱氨酸组织蛋白酶选择性的重要因素，某些半胱氨酸组织蛋白酶具有结构上的刚性，使其对特定底物结构有较高的选择性。

通过结合蛋白质组学数据和结构分析深入探索半胱氨酸组织蛋白酶选择性的分子机制。

这种综合的研究方法可以帮助我们理解蛋白质酶在生物体内的作用和调控机制，为开发具有高度选择性的药物靶点提供重要线索。

参考文献

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