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引言

革兰氏阴性植物病原菌油菜黄单胞菌（油菜病菌）是十字花科植物黑腐病的病原菌，本研究对Xcc galE基因进行了表征。

虽然生物信息学分析揭示了黄单胞菌中几个同源的galE基因，但没有一个被功能表征或检测，也没有关于黄单胞菌中galE活性的描述。

为了研究galE编码产物的酶活性，我们将galE编码区克隆到pET30b中生成pETgalE，并将其作为模板，在大肠杆菌S30蛋白表达系统中进行体外表达。

序列分析和突变分析表明，Xcc galE编码一个UDP -半乳糖4-二聚体酶(EC 5.1.3.2)，可催化UDP -半乳糖和UDP -葡萄糖的相互转化。

进一步研究表明，Xcc galE突变体的生物膜形成能力降低，报告者分析显示，galE转录在不同的培养条件下表现出不同的表达谱，受分解代谢物抑制，并受到Clp和RpfF的正调控。

本次实验还绘制了galE转录起始位点，这是首次在十字花科病原菌Xcc中鉴定出UDP -半乳糖4- 向异构酶。

一、历史研究背景、实验设计及原理介绍

UDP -半乳糖4-二聚苯胺酶，也称为UDP-glucose 4-epimerase，是一种负责UDP -半乳糖和UDP-glucose相互转化的酶。

UDP -半乳糖通常作为糖蛋白和复合脂多糖中半乳糖残基生物合成的供体分子，GalE也是许多细菌病原体的重要毒力因子，如淀粉杆菌、霍乱弧菌、牙龈卟啉单胞菌和嗜水单胞菌。

油菜黄单胞菌是一种引起十字花科植物黑腐病的植物致病菌，Xcc对植物的毒力取决于许多因素，包括分泌几种细胞外酶(如蛋白酶、纤维素酶和甘露聚糖酶)、产生胞外多糖和细胞运动的能力。

这些决定因子的表达被cAMP受体蛋白样蛋白(Clp)和RpfF上调，RpfF是合成扩散信号因子所需的烯酰辅酶a水合酶同源物。

在Xcc菌株ATCC33913、8004和B100的全测序基因组以及菌株Xc17的基因组序列已经标注了一个潜在的galE基因。这些假定的大风基因的生物学功能尚未得到研究，而鉴于GalE是多种细菌中重要的毒力因子，提示GalE可能在Xcc中发挥类似的生理作用。

为了解决这种可能性，本研究的目的是表征Xcc中假定的galE基因。

二、材料与方法

2.1. 菌株、质粒、培养基和生长条件

Luria-Bertani (LB)液体培养基和LB琼脂(Miller 1972)是培养大肠杆菌和Xcc的通用培养基，温度分别为37°C和28°C。

XOLN为含有0.625 g/l色氨酸和0.625 g/l酵母提取物的基础盐培养基，根据需要补充甘油、葡萄糖或半乳糖(2%)。根据需要添加氨苄西林(50 μg/ml)、卡那霉素(50 μg/ml)、庆大霉素(15 μg/ml)、四环素(15 μg/ml)。

2.2 重组GalE蛋白的制备及定点诱变

采用引物对490NdeI/1638XhoI进行pcr扩增，得到含有Xc17 galE基因完整编码序列的1149 bp片段，并连接到yT&A克隆载体(yeeast)上生成pTgalE。

序列确认后，从pTgalE中切除片段，克隆到pET30b表达载体中，得到pETgalE。

使用pETgalE作为重组GalE蛋白生产的模板，按照生产商的说明，使用Promega的S30 T7高产蛋白表达系统表达克隆的GalE。

37°C振荡(200 rpm)孵育1小时，评价合成蛋白的GalE活性，作为阴性对照，使用pET30b来澄清GalE活性分析的蛋白表达背景。

利用pTgalE作为模板引物，在GalE高度保守的活性位点残基(S123A、Y147A或K151)上构建突变，验证DNA序列后，将突变的galE克隆到pET30b中，得到pETgalES123A、pETgalEY147A和pETgalEK151A。

2.3 galE突变体的构建与互补

将pcr扩增的pTgalE中1149 bp的gale编码区切除并克隆到pUC19G中，得到pUCgalE。

以卡那霉素耐药菌株的基因组DNA为模板，通过引物对490NdeI/1638XhoI扩增插入galE区的Km(R)药盒,同时以Xc17为模板进行PCR扩增比较。

为了构建SC17互补质粒，我们使用302XbaI/1670BamHI引物对包含上游178-bp片段和Xc17 galE整个编码区的1369-bp片段进行pcr扩增，并将其克隆到广宿主载体pRK415中，生成pRKgalE。

将pRKgalE质粒电穿孔到突变体SC17中，以补充galE突变体。

2.4 细胞提取物制备及GalE活性测定

细菌在LB培养基中培养过夜，用添加2%甘油的新鲜XOLN稀释至OD(550) = 0.35，然后继续生长。

24 h后，在4℃下12,000 × g离心2 min，然后冲洗细胞，在50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中重悬，超声提取细胞提取物(10 s脉冲周期和10 s冰敷2分钟)。

超声处理后，离心除去细胞碎片和完整细胞，收集上清部分用于GalE酶活性测定。

GalE活性测定在前人的基础上，我们进行了一些修改：将1 ml Tris-HCl缓冲液(50 mM, pH 8.0)、24 μl MgCl(2) (250 mM)、12 μl NAD(+) (50 mM)、20 μl UDP -葡萄糖脱氢酶(0.75 U/ml)和114 μl细胞提取物组成的测定混合物加入1.5 ml微离心管中。

将30 μl UDP -半乳糖(8.2 mM)加入37℃水浴管中开始反应，孵育10 min后，在340 nm处测量混合物的吸光度增加，并与相同条件下的空白运行进行比较。

OD(340)的增加源于NADH的形成，并通过消光系数6220 M(−1)cm(−1)转化为纳米产物，一个单位(U)的GalE活性被定义为在实验条件下每分钟产生一纳摩尔NADH的酶的量。

2.5 启动子活性测定及生物信息学分析

利用引物对176PstI/510XbaI对galE基因上游区域进行pcr扩增，并将其克隆到pFY13-9中的无启动子lacZ基因前面，生成pFYgalE。

通过电穿孔将携带nt - 113/+222相对于galE TIS区域的Construct pFYgalE导入不同的Xcc菌株，在指定的时间间隔内获得三份样品，并测定β-半乳糖苷酶活性，如前所述，酶活性以米勒单位表示。

使用ClustalX软件包生成所选gale的多个序列比对，利用PDBsum数据库中获得的蛋白质二级结构词典数据库方法，根据静电标准定义的氢键检测来分配二级结构定位。

三、基于基因序列的数据分析与讨论

GalE酶是扩展短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族蛋白的一员，多重序列比对结果显示，扩展SDR超家族的两个特征序列，位于辅助因子结合袋附近的基序，以及保守的酪氨酸在催化中起关键作用的基序。

由此我们推导出的Xcc GalE氨基酸序列与大肠杆菌、假芽孢杆菌、炭疽杆菌和嗜热杆菌分别具有57%(72%)、59%(70%)、40%(55%)和32%(46%)的同源性(相似性)。

大量的诱变、动力学和晶体学数据证实了Ser124(编号与大肠杆菌结构一致)、Tyr149和Lys153是表观酶活性的重要功能残基。它们位于Xcc GalE的Ser123、Tyr147和Lys151位点。

通过定点诱变进一步证实了它们对Xcc GalE酶活性的影响。

以载体pET30b为模板的大肠杆菌S30蛋白表达系统产生的内源性GalE活性为1.58 U/mg蛋白，以pETgalE为模板，GalE活性为5.08 U/mg蛋白，这些结果表明Xcc基因产物具有galE酶活性。

我们通过位点定向诱变产生了三种galE衍生物(S123A, Y147A和K151A)，将突变的galE分别克隆到pET30b中，生成的构建体随后用于galE活性测定。

基于序列比对，来自大肠杆菌的GalE是Xcc GalE同源性建模的最佳模板结构，因为它与Xcc GalE有57%的序列同源性，是所有已实验确定结构的GalE蛋白中最合适的模板结构。

Xcc GalE预测模型由12个α-螺旋和13个β-链组成，根据大肠杆菌GalE的结构数据，Xcc GalE折叠成两个不同的结构域，n端nadd结合结构域和c端UDP -糖结合结构域。

GalE酶促试验证实了GalE活性对GalE突变株的影响。Xc17和Xc17(pRK415)产生的向异构酶活性相似(9.50 U/mg蛋白vs. 9.55 U/mg蛋白)，表明pRK415不影响酶促测定。

正如实验假设，galE突变体的酶活性较低，而亲本菌株的酶活性较高(3.16比9.55 U/mg蛋白)，补充菌株的酶活性可恢复到野生型水平(8.26 U/mg蛋白)。

这些结果表明，galE编码了一种具有galE活性的蛋白质，负责将UDP -半乳糖转化为UDP -葡萄糖，galE突变并没有完全降低到galE活性水平，galE基因产物并不是Xcc中唯一负责产生UDP -葡萄糖的酶。

galE基因上游序列不含强大肠杆菌启动子，由于两个假定区域之间的低保守性和较大的间隔，所提出的序列基序是否可能作为Xcc galE基因的启动子元件，需要进一步的实验验证。

黄单胞菌的一致启动子序列尚未明确，对12个已知黄单胞菌基因的推定启动子区域进行比较，发现- 35和- 10附近的两个保守区域是TTGTNN和(T/G)ATNA(A/T)，它们相隔17-43 bp。

总结

虽然GalE在含多糖的半乳糖的生物合成和多种细菌的毒力中起着重要作用，但其在黄单胞菌中生理功能的程度和广度尚不清楚。

在本实验中，我们对推导的GalE氨基酸序列进行了功能表征，包括结构建模，并阐明了GalE基因在Xcc中的生理作用和转录调控。

从定点突变数据来看，推测的活性位点残基(Ser123、Tyr147和Lys151)与Xcc GalE的全部活性有关。

在大肠杆菌中，[GalE- nadh]与UDP -葡萄糖配合物的晶体结构显示与NAD或葡萄糖基c4 (OH)接触的S124、Tyr149和Lys153(对应于Xcc GalE中的Ser123、Tyr147和Lys151)。

以大肠杆菌GalE为模板的全息模型显示，这些残基的侧链在预测的三维结构中非常接近(图S1B):(i) Ser123与葡萄糖基- c4 (OH)形成氢键，(ii) Tyr147与NAD的烟酰胺环和葡萄糖基- c4 (OH)相关联，(iii) Lys151与NAD的核糖基-OH形成氢键。

许多物种的galE突变体在半乳糖存在的情况下在细胞内积累UDP -半乳糖，导致抑菌和溶菌。

嗜水假单胞菌和创伤假单胞菌的galE突变体在以半乳糖为单一碳源的最小培养基中生长，但在相同条件下与野生型菌株相比生长迟缓。

除GalE外，嗜水假单胞菌和创伤假单胞菌的基因组中还存在另一种UDP -己糖外基酶(Gne, EC 3.1.5.7)，该基因具有UDP - n -乙酰半乳糖胺4-外基酶和UDP -半乳糖4-外基酶的双重活性，可以提供GalE功能。

由于嗜水假单胞菌和创伤假单胞菌的galE突变体与野生型相比，galE活性降低了4 ~ 5倍，但并未完全丧失，因此在半乳糖补充条件下，galE突变体所保持的生长能力依赖于用于UDP -半乳糖代谢的基因。

在我们的研究中，Xcc野生型与galE突变体之间没有明显的生长速率差异，并且在galE突变后仍保留了30%的galE活性，这表明其他未知的蛋白质可能提供了galE功能。

galE基因参与了几种细菌病原体的生物膜形成，在Xcc中，galE突变导致对塑料表面的附着水平降低。

报告试验表明，galE的表达受分解代谢物的抑制，在半乳糖的存在下不被诱导。

芯片和报告基因分析均显示，galE转录需要Clp，Clp蛋白通过结合靶基因的启动子来发挥转录激活作用，它与大肠杆菌Crp具有相同的DNA结合特异性，并识别相同的保守DNA结合位点:tgtga - n6 - taca。

在galE上游地区没有发现与保守的clp结合位点相似的序列，因此，我们有理由推测，galE启动子是由一种需要Clp功能才能表达的调节蛋白调控的。

到目前为止，还没有在Xcc中研究galE基因，也没有在其他黄原体中研究galE基因的信息。

在本次实验中，我们证明了Xcc galE基因编码一种UDP -半乳糖4-聚合酶，其残基S123、Y147和K151是聚合酶活性的必需氨基酸。

Xcc galE基因的破坏导致细胞内galE酶活性的降低和生物膜形成能力的降低，galE基因的转录受不同培养条件的影响，受分解代谢物抑制，受Clp上调，并需要RpfF。本文首次报道了黄单胞菌galE基因的功能和调控。

参考文献

梁佳园，《xanK单位点突变对野油菜黄单胞菌菌黄素合成及黄原胶产物性质的影响》

张钰，《野油菜黄单胞菌中LysR类转录因子VrhR、VrhA和VrhB功能的初步研究》

蓝逆寒，《寄主植物中抑制十字花科黑腐病菌Ⅲ型分泌系统小分子化合物的鉴定》

陈群一，《野油菜黄单胞菌BioC蛋白的生物信息学分析》

关键词：