前言

肉鸡生长速率（GR）的密集选择会带来负面的后遗症，例如骨骼发育和免疫系统异常，心力衰竭和肉质恶化。在波兰，快速增长的鸡种群在增长率方面非常不均匀，这对家禽生产者来说是非常无利可图的。

【资料图】

因此，需要鉴定可以支持选择过程的锅炉GR遗传标记。下丘脑通过诱导重要的垂体激素与生长调节密切相关。因此，本研究使用这种组织来确定参与鸡生长控制的基因。

摘要

Ross 308是世界上最受欢迎的商用肉鸡杂交种。Ross 308鸡的特点是生长迅速，在早期发育高肌肉质量，提供了早期屠宰的可能性。通常，它们在孵化后第六周被屠宰，这与在生长速度、饲料效率、高肌肉质量、高性能和羽毛成熟度之间实现最佳平衡有关。

无论鸡群年龄如何，Ross 308种群中的大多数都表现出低均匀性生长速率（GR），其中GR估计为在规定的饲养期间体重（BW）的平均增加。这些差异在生命的最初几周就已经很明显，六周后，它们甚至可以在一个肉鸡种群中达到 1.5 公斤的体重，这对家禽生产者、屠夫和未来的加工来说是无利可图的。在不同的肉鸡品系中也描述了类似的观察结果。

另一方面，下丘脑在鸟类生物体中也起着首要代谢过程的调节作用。它通过刺激垂体来控制体温、饥饿、睡眠、生长和昼夜节律，垂体分泌控制其他腺体/器官的必需激素。例如，下丘脑释放诱导垂体生长激素（GH）分泌的生长激素（GHRH） - 最关键的生长因子。因此，下丘脑分子活性受多种外源性刺激的调节。

实验理论

因此，最新的高通量分子遗传工具用于测定这些过程。Kamineni 在他的博士论文中使用基于下一代测序（NGS）技术的RNA测序表明，肉鸡的热应激会增加限速酶的下丘脑基因表达，例如甾醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）和脂蛋白脂肪酶（LPL）。

反过来，Han等人使用miRNAom分析表明miRNA在下丘脑中起着至关重要的作用，用于确定鸡性腺快速发育的时间。而Piórkowska等人使用RNA-seq方法查明肉鸡出生后发育过程中下丘脑基因表达的变化。

本研究旨在确定肉鸡的不同生长速率是否反映了下丘脑基因的表达和基本分子过程的激活。这种方法能够缩小与肉鸡生长确定相关的潜在遗传标记的搜索范围。本实验使用基于下一代测序技术的转录组分析。

公鸡特征

在实验过程中，记录了所有鸡的育肥和屠宰性状。在孵化后第176周和第685周后，高生长率（HGR）公鸡分别比低生长率（LGR）鸟类重3克和6克。生长速度不影响脂肪水平，但影响腿部和乳房肌肉质量。此外，从第3周龄到屠宰，第6周和第55周龄屠宰的低生长率公鸡分别减少了461 g和2.2 g的饲料，并且表现出较高的饲料转化率（FCR）。

差异表达基因分析

超过90%的处理读数映射到鸡参考基因组（GCA_000002315.5），其中70%映射到外显子区域，9%映射到内含子。聚类分析排除了进一步处理的三个样本，一个是3周大的样品，两个是6周大的样品。统计聚类分析表明，这些样本与特定组中的其余样本明显不同，这可能是未知因素的结果。

使用DESeq2方法进行GR依赖性DEG分析，该方法确定了两个年龄组之间43个共享的DEG。它们编码参与黄体生成和卵泡刺激激素分泌（TBX3和CGA）、摄食行为（OXT、NPY、PMCH和BSX）和对病毒的防御反应（OASL、MX1、IFITM3、IFIT5和IFI6）的蛋白质。

与生长速率变化相关的下丘脑反应表明，195周龄和339周龄公鸡分别为1和5 DEGs（倍数变化≥0.05，调整后的P值≤3.6）（goo.gl/4XX5mt）。在较年轻的LGR公鸡中，编码主要参与器官发育（BSX，MGP，MMP2，MYH11，EGR1，PCDH15，FST，LECT2，TBX3和NPPC），甲状腺激素调节过程（CRYM，CGA和CPQ），激素水平调节（POMC，SLCO1C1，EGR1，GHR，CGA，TBX3，BLK，GAL，SLC30A8，BTK，ALDH1A1，DIO2，TTR和NR5A1）和摄食行为（BSX， 观察到PMCH，NPW，NMU和NKX2-1）。

反过来，老年 LGR 鸟类的 DEG 参与炎症反应过程的活性，包括对干扰素-γ（IRF9、CCL19、IFITM1、GBP1、IRF8、IRF7 和 IRF1）、T 细胞和 B 细胞活化（RAC2、DMB2、CD3E、B2M、CD3D、LCK、CD3E、PTPRC、FOS、BLNK、BTK 和 PTPN6）的反应，以及抗原呈递：I 类（ERAP1、 BFIV21、B2M、BF1和 TAP2），以及调节激素水平（BLK、TTR、CGA、POMC、SLCO1C1、DIO2、EGR1、ALDH1A1、SLC30A8、NR5A1、TBX3、GHR和 GAL）和摄食行为（GAL、FOS、PMCH、BSX、OXT和 STRA6）的不同信号通路。FC含量最高的6个基因分别为19周龄和3周龄LGR公鸡（goo.gl/6XX4mt）的ALB、MGAM、FGB和AVD、IFI5、CCL<>。

验证 RNA-seq 结果和 qPCR 分析

通过qPCR方法验证了4个DEG，然后使用Pearson相关与RNA-seq结果进行了比较。通过链接 goo.gl/5XX0mt 访问获得的结果。ALDH82A1的最低 R 系数为 1.2（P值 = 7.09E-1）。因此，qPCR分析证实了RNA-seq结果。LGR 和 HGR 公鸡组之间的比较表明，LGR 鸟类中 POMC、ALDH1A2、BSX、PMCH和 NPY基因的表达显著增加。反过来，OXT基因表达显示出相反的趋势。

POMC基因作为促肾上腺皮质激素（ACTH）、β-内啡肽、α黑色素细胞刺激素（αMSH）和β黑色素细胞刺激激素（βMSH）的前体。它由下丘脑弓核（ARC）释放，属于致厌食分子。在鸟类中，这种神经递质的调节与哺乳动物的调节有些不同，因为Tachibana等人观察到人工选择的高生长速率的肉鸡仅对高αMSH剂量敏感，这有助于抑制采食量。

反过来，Rice等人仅在餐后注射胰岛素后才显示，选定的高生长率肉鸡的下丘脑中的POMC表达增加。Honda等人还提出，肉鸡饲料消耗量的增加可能与缺乏β-MSH厌食作用有关，下丘脑POMC水平的增加与抑制食物摄入无关。关于POMC在鸟类中的模糊作用，Boswell和Dunn提出禽类下丘脑POMC在ACTH和β-内啡肽的产生中比α-MSH更显著。

因此，增加POMC表达会促进体重损失。然而，我们的结果显示，LGR公鸡中的POMCmRNA水平升高，其特征是采食量降低。这一观察结果支持了POMC厌食功能的论点;抑制饥饿和促进体重减轻。此外，在较年轻的公鸡中，发现阳性POMC神经元调节元件 - 同源盒蛋白NK-2同系物A（Nkx2-1）过度表达，来自POMC神经元的Nkx2-1消融导致成年雄性POMC表达降低，并轻度增加其体重和肥胖。

ALDH1A1、PMCH和GAL基因也因响应不同的GR而差异表达，并在LGR鸟类中表现出增加的表达。在哺乳动物下丘脑中，ALDH1A1 参与多巴胺的代谢 并降低其细胞外水平。Mebel等人指出，哺乳动物大脑腹侧被盖区释放的中脑边缘多巴胺（DA）与食物摄入的激励、强化和激励方面有关。此外，这种信号传导对高脂肪和糖含量的可口食物敏感，这些食物会激活DA奖励电路。

然而，在鸡中，脑室内注射多巴胺会减少食物摄入并诱发食欲减退。PMCH编码预黑色素浓缩激素，通过减少能量消耗和增加食物摄入来调节摄食行为。Sun等人在鸡身上发现了错义PMCH变异与在乳房和腿部肌肉中测量的剪切力之间的关系，但对生长性能没有影响。在本研究中，观察到两个年龄段的 LGR 鸡的 ALDH1A1和 PMCH表达增加，在第 3 周和第 6 周之间，这些差异呈下降趋势。

此外，LGR鸟类的生长速度和采食量降低，这与鸟类下丘脑中两种分子的成矿功能相矛盾。GAL编码甘丙肽，甘丙肽被认为是哺乳动物的急性摄食行为刺激剂。Fang等人描述了内源性甘丙肽有助于调节葡萄糖摄取，因为它可以降低胰岛素抵抗并提高其敏感性。

在鸟类中，甘丙肽的作用尚不明确，因为可以找到相互矛盾的文献证据。同时，本研究发现6LGR肉鸡的下丘脑GAL表达增加，其中低体重可能是采食量低的结果。目前的结果否认了至少在肉鸡的这个发育阶段产矿甘丙素的作用，尽管Tachibana等人表明甘丙肽在脊椎动物中的功能是恒定的。

cDNA文库构建

来自下丘脑的RNA被分离出来，正如Piórkowska等人所描述的那样。使用 TapeStation2200（美国帕洛阿尔托安捷伦）测量 RNA 的质量和浓度，获得的 RIN 值在 7.3 到 8.4 之间。对随机选择的 16 个下丘脑样本进行 RNA 测序，这些样本在两个年龄段均呈现 HGR （n = 4） 和 LGR （n= 4）。

cDNA 文库由 TruSeq RNA 样品制备试剂盒 v2（美国加利福尼亚州圣地亚哥市伊鲁米纳）根据协议制备，并使用单个适配器（文件 S1）进行索引。使用Piórkowska等人描述的TruSeq Kit v101-HS化学在HiScanSQ系统（美国加利福尼亚州圣地亚哥市Illumina）上进行3 bp单端循环测序。

核糖核酸序列结果验证

使用RPL4和SDHA作为内源性对照，通过qPCR验证第八个基因。qPCR试剂在补充材料中提供。Pearson的相关性（SAS Enterprise v. 7.1）用于比较RNA-seq和qPCR结果。根据它们与荷尔蒙调节的关系选择用于验证的基因。

对36只公鸡的转录本丰度进行了估计，这些公鸡在两个年龄（3周龄和6周龄的鸡）和两个GR组。采用标准曲线法估计qPCR。使用δ-δCT法计算相对转录本数量，并通过方差分析（邓肯事后检验;具有默认设置的 SAS 企业版 v. 7.1;SAS研究所，美国卡里）。

结论

结果揭示了饱腹感中心与生长过程之间的强烈关联。本研究为肉鸡下丘脑调节提供了新的见解，并缩小了寻找遗传资源遗传标记的区域。

参考文献

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