前言

高等甲壳类动物是物种最丰富、形态最多样化的非昆虫节肢动物类，其许多成员具有重要的商业意义。尽管甲壳类动物的DNA序列信息呈指数级增长，但对Malacostraca的基因组组织知之甚少。在这里，我们构建了一个细菌人工染色体（BAC）文库。

并进行了BAC末端测序，为甲壳类动物中最广泛养殖的物种之一kuruma shorma虾提供基因组信息，并在BAC文库中发现了冗余序列的存在。我们检查了包含冗余序列的BAC克隆，以进一步分析其在kuruma虾基因组中的长度，拷贝数和位置。

Mj024A04 BAC克隆包括一个冗余序列，包含27个假定基因，似乎显示出正常的基因组DNA结构。值得注意的是，在推定的基因中，3个基因将同源蛋白编码为细胞凋亡蛋白抑制剂，7个基因将同源蛋白编码为白斑综合征病毒，白斑综合征病毒是一种已知影响甲壳类动物的致命病原体。

(相关资料图)

对381个BAC克隆的集落杂交和PCR分析表明，几乎一半的BAC克隆保留了DNA片段，其序列与代表性的BAC克隆Mj024A04同源。在kuruma虾核基因组中多次检测到Mj024A04部分序列，计算出的拷贝数至少为100。基于微卫星的BAC基因分型清楚地表明，Mj024A04同源序列是从至少48个不同的染色体位点克隆而来的。与水蚤和果蝇的可用基因组序列缺乏微共性关系，这表明这些片段在当前节肢动物基因组序列中的kuruma虾中具有独特性。

摘要

甲壳类动物的基因组大小差异极大，最小的甲壳类动物的C值为0.14 pg，最大的基因组重64.62 pg，相差460倍。尽管甲壳类动物的经济重要性和巨大的生物量产量，但人们对甲壳类动物的基因组组织知之甚少，尤其是马拉科斯特拉卡（包括虾和蟹），除了存在许多重复序列。

最近，尽管甲壳类动物水蚤水蚤的基因组DNA序列已经确定，但对甲壳类动物基因组做出任何结论似乎都不合适，因为最近基于DNA序列数据和六足动物（包括昆虫）和甲壳纲之间的形态比较的系统发育分析提供了一个意想不到的发现，即分支足类（包括水蚤水蚤）在系统发育上更接近六足动物而不是Malacostraca 。因此，需要阐明甲壳类动物基因组，特别是分支足类和六足类群与其他姊妹类群之间的遗传差异。

在马拉科斯特拉卡被归类为Decapoda的Penaeid虾一直是深入研究的主题。由于其商业价值，过去几年中发表了几篇关于表达序列标签（EST）分析和遗传连锁图谱的论文。然而，它们的大基因组的深度信息在很大程度上是未知的，估计其大小约为人类基因组的70%，并且富含AT和AAT序列。

作为了解虾基因组组织的第一步，我们从kuruma虾（Marsupenaeus japonicus）构建了一个BAC文库（名为MjBL2），并进行了BAC末端测序。结果清楚地表明，在MjBL2文库的许多BAC克隆中，某些序列存在极端冗余。我们选择一个BAC克隆（Mj024A04）对其整个序列和虾基因组中的冗余进行详细分析，并发现了许多包含Mj024A04序列的DNA片段拷贝。这表明这种特殊DNA片段的超扩增是通过kuruma虾基因组进化过程中的节段复制事件发生的。

BAC文库构建和BAC末端测序

为了概述库鲁玛虾核基因组的组成和组织，我们使用由2只虾的血细胞制备的库ruma虾基因组DNA构建了BAC文库（MjBL13），并分析了BAC末端序列（BES）。MjBL2由49，152个BAC克隆组成，排列在128个微量滴定板中并储存在-80°C。 通过 NotI 消化 135 个随机选择的 BAC 克隆，平均插入片段大小估计为 205 kb。

使用从MjBL192中随机选择的2个BAC克隆进一步进行BES分析，并组装检索到的读数以实现连续性[DDBJ：AG993477-AG993734]。所得BES被分为29个单例和51个连续序列，包括2至24个读段。值得注意的是，BLASTN和BLASTX分析显示，这些BES中的许多（BLASTN中有20个读数，BLASTX中有55个读数）含有编码类似于黑虎虾（斑节对虾）中报告的“细胞凋亡蛋白抑制剂（IAP）”的蛋白质序列。

代表性BAC克隆的DNA序列

从MjBL024中随机选择具有类似“黑虎虾IAP”基因的BAC克隆（Mj04A2），采用鸟枪法测序方法对其整个DNA序列进行详细分析。通过计算机注释分析所得的120 kb基因组DNA序列（Mj024A04序列），揭示了27个推定基因，这些基因显然似乎是具有外显子内含子结构的正常基因组区域[DDBJ：AP010878]。

在序列侧翼基因09的中间发现了大的GGTTA重复序列，该基因编码类似于红泷河豚逆转录酶的蛋白质。值得注意的是，在其他26个基因中，三个基因（基因01、06和24）编码与三个物种的IAP同源的蛋白质，非洲爪蟾（非洲爪蛙），黑腹果蝇（果蝇）和挪威鼠（挪威大鼠），七个基因（基因11，13，14，15，16，17和18）与“白斑综合征病毒（WSSV）”中的ORF同源， 主要的虾致病性dsDNA病毒，对虾以及其他甲壳类动物如螃蟹和小龙虾具有高毒性。

间间虾基因组中Mj024A04序列及其拷贝数的检测

接下来，我们采用Southern 印迹杂交，使用几种不同的限制性内切酶检测库鲁玛虾基因组中 Mj024A04 序列的多个拷贝。结果显示，4个假定基因（基因01、09、16和27）中的每一个都有多个DNA条带，证实了这些基因的多个拷贝的存在。此外，我们使用标记的Mj024A04 BAC克隆进行了荧光原位杂交（FISH）。

FISH图像清楚地显示了成年虾睾丸细胞核中的许多荧光斑点。随着大重复序列的重复，我们使用由01个不同器官（脑，血细胞，心脏，睾丸，肌肉，泳腿和肠）和09个幼虫制备的基因组DNA通过基因16，27，7和3的定量PCR进一步检查了推定基因的拷贝数。

我们的结果表明，这些推定基因的拷贝数是推定单拷贝基因谷氨酰胺转氨酶（TGase）的100倍，除了基因09（逆转录转座子）。这表明存在多个Mj024A04序列拷贝。综上所述，我们的结果表明，大DNA片段Mj024A04在基因组中多次出现。

Mj024A04序列中推定基因的BAC基因分型和PCR检测

为了排除可能的克隆偏倚，我们使用三种微卫星多态性进行了BAC基因分型。从MjBL299板342至2筛选的001个F，M，R阳性BAC克隆中检测到008个不同的基因型，代表虾基因组的0.2覆盖率。对从不同基因型中选择的八个独立的BAC克隆进行的基于PCR的推定基因检测显示，几乎所有17个推定基因都存在。假设所有虾都有异质染色体，应该检测来自一个等位基因的两种基因型。

由于我们从2个个体构建了MjBL13文库，因此一个染色体位点最多预计有26个不同的单倍型。检测到的299种不同基因型表明，至少有11个不同的染色体位点包含整个Mj024A04序列的重复。

BAC文库构建和BAC末端测序，用于首次表征kuruma虾基因组

据报道，库鲁玛虾核DNA的含量为2.83pg，表明库鲁玛虾的基因组大小与其他对虾（如南美白对虾和斑节对虾）几乎相同，据报道其基因组大小约为2，000Mbp。在这项研究中，我们首先从kuruma虾构建了BAC文库。MjBL2 BAC克隆的平均插入片段大小估计为135 kb，总MjBL2插入片段大小可计算为约6，600 Mbp，表明MjBL2代表了kuruma虾基因组覆盖率的3.3倍。

虽然MjBL2不适合物理定位和基因组测序，因为它是由13只虾构建的，但MjBL2作为表征kuruma虾基因组的第一步是有用的。我们进行了BES分析，以首次了解未测序的kuruma虾基因组的序列组成。BES分析的结果非常令人惊讶，因为即使只分析了192个克隆，我们也检测到了51个重叠群，每个重叠群包含多个读数，从2到24不等。

这表明，按照典型的BAC构建方法，我们在kuruma虾基因组中获得了相同DNA片段的多个拷贝。然而，我们用BLAST注释的黑虎虾IAP基因同系物等推定基因似乎不像转座元件那样具有潜在的重复活性。为了进一步确定库鲁玛虾基因组的异常，我们进一步分析了库鲁玛虾基因组中的这些DNA片段。

代表性BAC克隆Mj024A04的基因内容

对具有黑虎虾IAP序列的BAC克隆随机选择的Mj024A04 BAC克隆进行全测序，并在计算机中预测了27个基因。在预测的27个基因中，我们发现三个基因与IAP同源。众所周知，细胞凋亡是受控细胞自杀的遗传程序途径，在发育、组织稳态、DNA损伤反应和病理过程等多个过程中具有关键作用。

IAP已被证明通过直接结合IAP中存在的杆状病毒IAP重复（BIR）结构域来抑制半胱天冬酶（凋亡机制的核心成分）的蛋白水解活性来阻断细胞凋亡。称为含BIR结构域的蛋白质（BIRP）的细胞同系物的特征在于存在可变数量的BIR结构域。这些同系物已在酵母、线虫、苍蝇和高等脊椎动物中发现。

在果蝇中，已发现1种IAP同系物（Thread或IAP2、IAP12265、Bruceand Deterin或CG24）。 我们分析了推定基因06，24和9与几种生物体中其他BIR结构域的系统发育关系。推定基因24中的BIR结构域与黑虎虾IAP基因中的BIR结构域聚集在一起，表明推定基因25可能与黑虎虾IAP具有相同的功能。

特别令人感兴趣的是，推定基因22包含五个BIR结构域，这是第一份关于包含三个以上BIR结构域的BIRP的报告。已知BIR结构域在蛋白质-蛋白质相互作用中起重要作用，并且已经表明，单个蛋白质分子中存在多个BIR结构域增加了BIRP对目标蛋白质的亲和力。

此外，BIRP可以相互作用的目标分子范围也随着BIR结构域的数量而增加。因此，具有五个BIR结构域的推定基因<>可能是一种具有不同功能的新型BIRP。

结论

我们的结果表明，大DNA片段的超扩增发生在kuruma虾基因组中。虽然我们只分析了部分重复的DNA片段，但我们的结果表明，按照正常的分析方法很难分析虾基因组。因此，在研究虾基因组中的其他独特结构时，有必要避免重复序列。

参考文献

关键词：