前言

在本研究中，我们描述了我们的全钛微电极阵列（tMEA）制造工艺，并表明未包被的钛微电极完全适用于测量神经元和心肌细胞的场电位（FP），许多新颖的研究问题需要定制设计的微电极配置，这与少数市售的微电极配置不同。

(资料图)

由于可能需要几种不同的配置，特别是在原型制作阶段，因此可以通过省略额外的低阻抗微电极涂层（通常由氮化钛（TiN）或铂黑制成）来节省MEA制造中的大量时间和成本，而是具有简化且易于加工的MEA结构。

对我们的未包被钛微电极和商用TiN包被微电极进行了噪声、阻抗和原子力显微镜（AFM）表征，并通过两个平台上神经元和心肌细胞的FP测量进行补充，尽管与商业MEA相比，噪声水平增加，但我们的tMEA从神经元和心肌细胞中产生了良好的FP测量，因此，tMEA为开发定制设计的电极配置和更复杂的监测环境提供了一个经济高效的平台。

实验的目的以及预览

具有金、铂或氧化铟锡（ITO）微电极而无需额外涂层的MEA是市售的，但某些方面，例如材料成本和加工困难，使这些材料对简单和低成本的制造方案的吸引力降低，另一方面，钛是一种常见的、易于加工且高度生物相容的电极材料，然而，钛并未被用作唯一的MEA微电极材料，而总是仅作为其他金属的薄粘合层或涂有氮化钛（TiN）。

反对使用没有额外涂层的钛微电极的理由可能是存在几纳米厚的介电天然氧化物（TiO2）层，总是在空气中的钛表面上形成，然而，已经提出通过薄介电层的直接隧穿，导电亚氧化物的存在，以及在钛沉积之前来自玻璃表面的杂质，以解释通过天然氧化层的局部电子转移，从而产生足够的导电性。

本研究的目的是表明，没有任何额外表面涂层的钛微电极的FP测量能力与当今使用的标准微电极相当，如本文所示，使用我们的内部MEA（后来称为tMEA），这种微电极完全能够对神经元和心肌细胞进行FP测量，产生的信号质量足以满足预期的分析目的。

tMEA制造

我们内部制造的 tMEA 有 58 个 8 × 8 方形矩阵格式的微电极，每个角缺少一个微电极，靠近中心线的两侧缺少两个微电极，基体两侧有两个大电极，可用作测量参考电极、接地电极和刺激电极，在第一批tMEA（后来称为旧tMEA，因为在噪声和阻抗测量之前用于生物测量）中，所有微电极都是方形的，尺寸约为30×30μm。

第二批tMEA（后来称为新tMEA，因为在其他测量之前不用于生物测量）遭受某些加工条件故障，导致微电极尺寸变化和预期方形的舍入，平均微电极直径为23μm，为了验证噪声性能与电极面积依赖性的关系，一些微电极被放大（直径55μm），所有tMEA的电极间距离为200μm。

简而言之，由于其高机械耐用性，选择了 0.9 mm 厚的肖特 Desag D263 玻璃（德国美因茨肖特）作为基板材料，玻璃被切割成49×49毫米大小的晶圆，用洗碗液，水和乙醇清洗，并在Oplatek Oy（芬兰Leppävirta）涂有300纳米钛层的电子束中清洗，在进行下一个光刻步骤之前，用丙酮、2-丙醇和去离子水清洁玻璃晶片。

旋涂的六甲基二硅氮烷（HMDS，Acros Organics，Geel，比利时）用作光刻胶附着力促进剂，然后立即将ma-P 1225正性光刻胶（微光刻胶技术，德国柏林）旋涂至∼2.2μm厚度，进一步烘烤在晶片上，接下来，将激光光印掩模的微电极图案进行紫外曝光、显影并在光刻胶上硬烤。

湿法蚀刻（20小时2O：1 小时2O2（30%）：1 HF）用于将微电极图案从光刻胶层转移到钛上，从剩余的光刻胶中清洁晶圆后，500 nm的氮化硅层（Si3N4）作为介电绝缘层沉积在光电研究中心，在绝缘体层中为电极和接触垫开口的光刻步骤与上述钛图案化相同的程序进行。

然而，在硬烘步骤之后，用SF6和 O2应用气体[40]代替湿法蚀刻，在最后的制造步骤中，短氧等离子体处理（O230 sccm，射频功率 30 W，压力 30 mTorr），在反应离子蚀刻机（RIE，Advanced Vacuum Vision 320，Advanced Vacuum，Lomma，瑞典）中运行，使表面具有亲水性。

培养基每周更换3次，将细胞在三个tMEA和三个cMEA上体外（DIV）培养21天，每周一次测量神经元网络的自发活动，每次五分钟，神经元动作电位尖峰检测基于信号标准差与信号平均值的五倍的幅度阈值进行，此外，每周拍摄相差显微镜图像。

结果和讨论

与Pt黑色涂层微电极相比，通过省略额外的微电极涂层，我们能够节省至少一个沉积步骤，与TiN涂层相比，我们能够节省一个沉积和一个剥离工艺步骤，根据所选的制造方法，CNT和IrOx涂层可能需要更多的工艺步骤。

切割工艺步骤不仅可以节省时间和金钱，还可以降低工艺失败的风险，并提高制造工艺的可重复性，在MEA上集成传感器或细胞生长导向结构，或用某些聚合物基材料替换化学和耐热的玻璃基板或氮化硅绝缘层的情况下，对于最敏感的层或力来说，每个额外的工艺步骤都可能是致命的，以便在制造工艺链中进行不切实际的改变。

噪声分析

即使由于难以定义每个任意形状微电极的确切面积而省略了精确的统计分析，但粗略比较新tMEA的正常约23μm微电极和55μm对照微电极之间的RMS噪声水平使我们能够得出结论，至少平均而言，tMEA遵循电极噪声与电极面积平方根成反比的理论，我们能够对tMEA的RMS噪声数据进行归一化，以对应cMEA的电极尺寸，即直径为30μm。

典型的噪声电压谱如图所示，来自旧tMEA的一个微电极和旧cMEA在用培养基填充MEA后0、1和2小时，包括200小时时间点来自相同微电极的1 bin噪声电压直方图，两种MEA类型在整个频率范围内都具有相当恒定的频谱行为，作为时间的函数，不包括tMEA频谱中0小时至1小时之间非常低频率的明显下降。

在大约2，640 Hz时，两种MEA类型都表现出一个峰值，我们假设该峰值来自放大器电子设备，一般而言，某些所有类型的MEA的某些微电极也表现出其他偶发峰，这是由实验室中的一些随机附加活性或某些MEA或微电极特异性缺陷引起的，可观察到的50 Hz电源频率峰值在tMEA中比cMEA更常见，直方图的形状在这两种情况下都类似于高斯图，但可以假设，tMEA 的分布更宽。

阻抗幅度分析

研究给出了在1 kHz下测得的平均阻抗，并通过相对于cMEA电极的微电极面积归一化，并给出了相应的平均RMS噪声值，旧多边环境协定的tMEA阻抗平均比相应的cMEA高60%，新多边环境协定的阻抗平均高130%。

cMEAs测得的阻抗幅度值与之前报道的值处于同一水平，由于以前没有关于钛MEA的报告，因此没有与tMEAs相对应的早期结果进行直接比较，然而，据报道，未包被和TiN包被的金微电极的阻抗差异为一个数量级。

相应尺寸的Pt和ITO微电极的阻抗高于800kΩ，即使由于阻抗测量安排和微电极尺寸的明显差异，不同的研究不完全可比，钛微电极的阻抗特性仍然可以被认为是与其他单一材料微电极的竞争力。

tMEA和cMEA微电极表面的典型AFM图像，由于TiN涂层的柱状形态，AFM悬臂只能测量TiN涂层的最顶面，与未涂层的钛相比，有效表面积增加不超过10%。

我们怀疑我们的AFM未能传达精细表面结构的完整信息，导致低估了tMEA和cMEA之间的有效表面积差异，tMEA和cMEA之间的噪声和阻抗值的差异是由于不同的表面微观结构以及不同的表面电化学（包括钛的自然氧化）导致的有效表面积差异。

tMEA 上神经元的活力和电信号传导

神经元聚集体成功附着到所有MEA上，细胞的活力在tMEA和cMEA上相似，神经元开始生长过程，一些细胞沿着这些过程迁移，更详细地说，神经元细胞在tMEA表面上形成神经网络，并用钛微电极测量网络的自发活性，在cMEAs中观察到的相应自发活动见，同样，在MEA培养的第一周，在两种MEA类型上都检测到第一个单独的加标。

如前所述，信号传导发展为更有组织的类似火车的活动，甚至爆发活动，tMEA的噪声水平是cMEA的两倍，但峰值也是cMEA的两倍，因此，tMEAs显示出与cMEA相当的信噪比（S/N），结果支持全钛MEAs作为一种高效且可调的工具，用于测量不同电极布局的神经元活动和成熟度。

tMEA 上心肌细胞的活力和电信号传导

跳动聚集体在tMEAs上粘附良好，与cMEA上播种的聚集体相比，粘附性能没有差异，经检查，心肌细胞聚集体表现出较强的自发收缩性，我们能够使用tMEAs记录心脏FP活动，记录的最高质量信号在毫伏范围内，自发跳动的hESC衍生心肌细胞产生的FP信号，从DIV 4开始，这是记录的第一天，tMEA和cMEA都能很好地检测到。

信号幅度随着时间的推移而变大，达到DIV 7的峰值，到那时，信号的形态也得到了更好的定义，其标志是信噪比更高，这是收缩压峰值幅度较大的直接结果，这表明心肌细胞对MEA的细胞粘附更强，细胞之间的连接更好，更成熟。

与cMEA相比，tMEAs在同一MEA的记录之间的背景噪声水平往往有更大的变化，可以用tMEA充分和重复地记录心脏药物效应，已知hERG通道阻滞剂E-4031可延长QT时间和FPD，使FPD延长约50%，所有这些都表明，全钛MEA可用于药物测试的概念验证，并且产生的信号的分辨率足以检测FP形态的变化。

最终结论

我们对hESC衍生神经元和心肌细胞的实验表明，当考虑记录来自神经元细胞或心肌细胞的FP信号时，全钛MEA微电极的性能与具有TiN涂层微电极的MEA相当，对于需要检测非常微弱的信号或精确信号形态的某些类型的应用，全钛MEA尽管具有相当的信噪比，但由于背景噪声和波动较高，可能不是最佳选择。

全钛技术在修改MEA平台以备将来使用方面为我们提供了几个优势，其中包括能够以成本和时间有效的方式设计和制造各种MEA布局和微电极配置，例如，用于更复杂的神经元网络几何形状或心肌细胞合胞体和连接研究的实验设置。

参考文献

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