文|浮生

【资料图】

编辑|浮生

前言

在许多生物中，通过基因沉默或编辑已经成功地抑制了特定的基因功能，然而，使用细胞毒素基因还没有实现抑制靶组织功能的遗传操作。在这里我们建立了具有后部丝腺(PSGs)的转基因蚕，其表达细胞毒素pierisin-1A (P1A)的酶结构域，以此来验证通过靶向P1A表达的新方法可用于开发具有组织特异性功能障碍的生物学有用的模式生物。

截短的P1A在家蚕PSG中的表达和生理影响

白菜蝶衍生的P1A与凋亡诱导体液蛋白Pierisin-1有75%的氨基酸相同，体外翻译的P1A蛋白表现出ADP核糖基化活性，表现为底物[32P]NAD的ADP核糖基转移到DNA上；然而，反应产物的HPLC分析显示，与pierisin-1相比，P1A的DNA ADP核糖基化活性为5%∼（P < 0.001）。

用载体进行转染实验，然后用免疫印迹法证实P1A的N端部分含有DNA ADP核糖基转移酶结构域（P1A269）在昆虫培养的细胞系，即B. mori衍生的BM-N和Spodoptera frugiperda衍生的Sf21中瞬时表达。

P1A269和全长P1A的异位基因表达对BM-N细胞造成了独特的非凋亡效应，其特点是扁平细胞数量的增加和报告蛋白合成的抑制。

为了探索细胞内表达的P1A269在特定组织中的功能后果，我们产生了转基因蚕系w1-pndP1A269/P1A269，它携带一个均匀的转基因，在纤维蛋白重链（FibH）启动子控制下表达P1A269，这在PSG中特别活跃。P1A269的作用预计仅限于PSG，因为它被设计成既缺乏P1A从PSG细胞分泌所需的信号序列，又缺乏其侵入靶细胞所需的C端受体结合域。

反向PCR和DNA数据库分析显示，该转基因被插入到16号染色体中，通过使用免疫印迹和SDS/PAGE，表达的P1A269蛋白可以在第五龄的第6天在幼虫PSG中检测到，这与从环状病毒多面体包被的P1A269和表达P1A269的Sf21和BM-N细胞分离的对照样品相似。

在幼虫阶段，P1A269的蛋白表达在第四龄的第4天和第五龄的第3和第6天增加，但在第五龄的第7天减少。定量RT-PCR也显示，P1A269的mRNA表达在第五龄期的第3天和第6天增加。

从w1-pndP1A269/P1A269幼虫中解剖出来的PSG并没有因细胞凋亡而消亡，而是表现出形态上的异常，如与未转化的w1-pnd+/+幼虫的PSG相比出现凹陷。在本研究中，w1-pndP1A269/P1A269的五龄幼虫在五龄的第6天开始旋转，并在第7天进行肠道清洗后继续剧烈旋转。

以前的研究表明，在第五龄期的第3天和第五龄期的后期，PSG中的FibH启动子活性随着幼虫分泌的蜕皮激素脉冲而增加。在第四龄期的第4天，本研究中的幼虫被认为处于蜕皮阶段，此时蜕皮激素脉冲会影响某些基因的表达。

因此，P1A269在第四期幼虫第4天和第五期幼虫第3天和第6天的表达可能受蜕皮激素分泌的控制，这表明蜕皮激素脉冲在幼虫发育过程中反复诱导P1A269的表达，而这正是PSG的异常出现的原因。

w1-pndP1A269/P1A269蚕的遗传性状

w1-pndP1A269/P1A269幼虫产生的薄层茧壳比w1-pnd+/+幼虫产生的茧壳重量少79%（P < 0.001），野生型蚕的茧壳由70%的纤维蛋白[FibH和纤维蛋白轻链（FibL）]、25%的丝胶蛋白和其他材料组成。

纤维蛋白是专门由PSG生产的生丝成分，而丝胶是主要由中间丝腺生产的胶状蛋白，通过将纤维蛋白线包围并粘在一起促进茧的内聚力。因此，w1-pndP1A269/P1A269幼虫制作的茧壳重量减少，被认为很可能是由于纤维蛋白含量减少。

梯度凝胶（5-20%）中的SDS/PAGE，然后用FibL特异性抗体进行免疫印迹，显示FibL和FibH蛋白存在于w1-pnd+/+幼虫的茧壳中，但不存在于w1-pndP1A269/P1A269幼虫的茧壳中，其中只有非纤维蛋白，主要是丝氨酸，可以检测到（丝氨酸1-4）。

定量RT-PCR分析显示，相对于w1-pndP1A269/P1A269幼虫，五龄幼虫的PSG中FibH和FibL的mRNA水平在相应天数的第5、6和7天强烈下降。事实上，在第五阶段的第7天，w1-pndP1A269/P1A269幼虫的FibH和FibL mRNA水平分别下降到w1-pnd+/+幼虫FibH和FibL mRNA水平的3.1%和0.9%（P < 0.001）。

相对于w1-pnd+/+幼虫的细胞质作用A3的水平，同一天w1-pndP1A269/P1A269幼虫的PSG中的mRNA水平似乎没有下降。这些结果表明，细胞内表达的P1A269抑制了转基因蚕的PSG中FibH和FibL蛋白的合成。

雄性和雌性w1-pndP1A269/P1A269蛹在化蛹后第三天的平均重量分别比雄性和雌性w1-pnd+/+蛹的平均重量高1.5和1.3倍（P < 0.001）。

这种额外的重量可能是由于保留了原本用于蛋白质生产的营养资源，特别是纤维素，这是蚕茧纺纱所需要的。事实上，在经典的实验中，通过手术切除第四和第五星幼虫的丝腺，会在化蛹前造成多余的体液氨基酸，如Gly、Thr、Ser和Tyr的积累，而切除整个丝腺的幼虫未能化蛹，可能是由于存在多余的氨基酸。

w1-pndP1A269/P1A269蛹在化蛹后没有表现出明显的发育缺陷；到目前为止，这些转基因蚕可以成熟到成年，并产生健康的后代，可以成功繁殖。这些结果表明，保留用于纤维素合成的营养资源似乎并没有对转基因蚕产生负面影响。

众所周知，在第一至第四次蜕皮期间纺出的非茧形丝线可将幼虫的原腿固定在表面，这种行为对支持幼虫蜕皮至关重要。

在本研究中，纺制不含纤维素的非茧丝的幼虫没有不脱皮的情况。这一结果与Takasu等人的证据一致，即支持幼虫蜕皮的野生型蚕的非茧丝几乎不含纤维素，而是主要由丝胶成分组成，特别是丝胶-2。

P1A269等位基因在家蚕育种中的应用

我们接下来建立了KWP1A269/P1A269品系，将养蚕业使用的商业蚕株（Kinshu x Showa）与w1-pndP1A269/P1A269品系交配，筛选出遗传标记（EGFP阳性眼）的个体，然后进行连续的同胞交配。该商品蚕品系产生的蚕茧比w1-pnd+/+更重。

由此产生的KWP1A269/P1A269幼虫产生丝胶茧壳，其中FibL和FibH蛋白通过SDS/PAGE和FibL特异性免疫印迹检测不到。

此外，KWP1A269/P1A269的茧壳比w1-pndP1A269/P1A269的茧壳重1.7倍（P < 0.001），这一结果表明，将w1-pndP1A269/P1A269品系与蚕遗传资源数据库（shigen.nig.ac.jp/silkwormbase/top.jsp）中描述的已知能生产重质茧的保存品系简单交配，可用于生产无纤维素的重质蚕茧

丝胶茧可用于制备水凝胶

通过对普通蚕茧的生丝脱胶制备的商业丝胶不能形成水凝胶，因为脱胶过程中的高温和碱性pH条件导致蛋白质分解，使丝胶不再能通过SDS/PAGE检测到。然而，完整的、可溶性的、不含纤维素的血清蛋白，其浓度可通过SDS/PAGE检测，可以很容易地使用6M LiBr从w1-pndP1A269/P1A269血清蛋白茧中制备。

然后用10%的乙醇孵育1小时后，可以诱导完整的、可溶性的丝裂霉素形成水凝胶，由于提取的低浓度丝胶溶液中纤维素的污染程度很高，因此不可能用同样的化学方法从野生型蚕茧中获得不含纤维素的完整丝胶溶液。

完整的可溶性蚕丝蛋白具有与胶原蛋白相似的保湿特性，并能在高达96%的水的溶液中凝胶化，完整的丝胶蛋白溶液在4℃下长期储存2-3周后会自主形成水凝胶。在4℃下长期储存后，丝胶蛋白结构的轻微改变似乎足以促进凝胶化；因此，加入乙醇可能加速了这一过程。

我们以前表明，封装在多面体中的细胞因子的活性，也就是丝胶蛋白微晶，可以在体外和体内环境中长期稳定地维持，并可以缓慢释放，不断刺激多种细胞类型的生长和分化。

因此，为了确定丝胶水凝胶是否能作为支架支持细胞生长和分化，我们在丝胶水凝胶上培养小鼠胚胎干（ES）细胞系EB5，该凝胶上覆盖着含有典型的重组人白血病抑制因子（rhLIF）或加入多面体包裹的LIF的介质。

在LIF存在的情况下可以保持未分化的EB5细胞可以增殖，形成特征性的圆顶状菌落，并表达碱性磷酸酶（ALP）。分化的EB5细胞在含有blasticidin的培养基中不能增殖，本研究中所有的培养都使用blasticidin。

在缺乏多面体的丝胶水凝胶上生长的对照培养物或纳入空多面体的培养物中，EB5细胞没有增殖并形成ALP染色的阳性菌落，从生长在对照水凝胶上的细胞中提取的ALP活性在培养后没有增加。

相比之下，生长在有多面体包裹的LIF的水凝胶上的EB5细胞和生长在有含rhLIF的培养基覆盖的水凝胶上的EB5细胞形成了圆顶状的ALP阳性菌落，其提取的ALP活性分别比在缺乏rhLIF的培养基中加入空多面体的对照水凝胶上生长的细胞高14倍和18倍（P＜0.005；图3B）；然而，这两个实验组之间没有明显差异（P＞0.05）。这些发现表明，只要有LIF，丝胶水凝胶可以作为支持EB5细胞生长的支架。

实验结果讨论

本研究产生了转基因蚕w1-pndP1A269/P1A269，其中PSG表达P1A的DNA ADP核糖基转移酶结构，命名为P1A269。P1A在家蚕细胞中的成功表达可能是由于其相对于强细胞毒性的Pierisin-1的酶活性较低，后者不能在任何种类的活细胞中表达。

细胞内表达的P1A269诱导了BM-N培养细胞中报告荧光素酶合成的抑制，在瞬时表达P1A269的BM-N细胞中，看到具有特征性扁平形态的细胞数量增加。

因此，BM-N细胞对P1A269的反应似乎与细胞周期停滞有关，并涉及进入静止期，这与蛋白质合成受损和激活应对DNA损伤的凋亡途径有关。

同时，P1A269诱导PSG细胞中FibH和FibL mRNA水平的下降，PSG细胞不增殖，但在幼虫阶段体积增长，表明P1A269具有抑制FibH和FibL基因转录的功能。

细胞质肌动蛋白A3 mRNA水平没有因为P1A269的功能而下降，表明P1A269抑制了一些基因的转录，包括与引入的P1A269的表达同时启动的纤维蛋白基因。因此，看来P1A269诱导的对一些基因的抑制可能是PSG细胞生长的原因，并导致观察到的形态异常。

P1A269的功能表面上看来是诱导了细胞质肌动蛋白A3 mRNA水平的增加，然而，由于P1A269的功能估计会抑制PSG中rRNAs转录率的大幅增加，据报道这与纤维蛋白的合成同时发生，因此最好认为该结果是一个不切实际的，从数据的正常化到P1A269改变的18S rRNA水平出现的数字事件。

到目前为止，在用细胞外的Pierisin-1处理哺乳动物细胞后，没有观察到除细胞凋亡外的其他细胞反应，因为Pierisin-1可以进入目标细胞。

因此，只有细胞内表达的P1A蛋白才有望诱发特征性的细胞反应，包括对细胞蛋白合成的抑制，这表明细胞内表达的P1A N端结构域可以引起位点特异性的非凋亡效应，既不会扩展到邻近的组织，也不会对个体的发育阶段产生影响。

P1A也可以在它诱导蛋白合成抑制的任何细胞中有效。因此，细胞内表达的仅编码N端酶活性区域的P1A可用于产生具有组织特异性功能障碍的模型生物，适用于各种遗传操作，包括在哺乳动物的癌细胞中诱导静止，以及开发用于糖尿病研究的胰岛功能受损或免疫系统功能受损的动物模型。

然而，为了将来在其他生物体内应用细胞内表达的部分P1A，我们必须首先了解P1A片段如何通过抑制蛋白质合成而不是诱导细胞凋亡来诱导PSG功能障碍。一种可能性是，细胞中一定水平的DNA ADP核糖基化需要抑制蛋白质的合成，但超过这个水平就会诱发细胞凋亡。

与BM-N细胞相比，P1A269在Sf21细胞中的表达更强烈，在那里它能刺激其凋亡的细胞死亡，这一观察支持了这一假设。因此，未来的研究需要调查在PSG中发生的蛋白质合成抑制是否取决于表达的DNA ADP核糖化活性的强度，以及如何通过调节控制P1A269表达的启动子或引入P1A269的氨基酸突变来调节P1A活性。

这项研究还发现，w1-pndP1A269/P1A269幼虫纺出的茧几乎不含纤维素，几乎完全由丝胶组成。以前的一项研究表明，表达Bcl-2相关的X蛋白的蚕PSG会变得消融，尽管这项研究没有提出关于茧和化蛹后被操纵个体的发展的信息。

此外，一份描述转基因蚕的T7 RNA聚合酶修饰的PSG的单独报告显示，FibL和FibH的表达减少但可以检测到，而另一项研究显示，转录激活剂样效应核酸酶介导的FibH基因中断的蚕产生的薄层蚕茧不含FibH，但FibL的水平正常。

Nd蚕株有一个影响丝腺的天然基因突变，产生少量的蚕茧，这些蚕茧有非常多的丝胶和不同比例的纤维素。我们的研究报告使用了一种细胞毒素，导致抑制PSG功能产生FibH和FibL，以及生产仅由丝胶组成的蚕茧。

结语

通过研究我们可以发现：在未来，可以进行进一步的育种，以产生具有中间丝腺的转基因蚕，该丝腺可产生包含多面体包裹的细胞因子的丝胶，从中可以制造出无病原体的人工细胞外基质，用于体内外应用。

这些蚕可以在它们的丝腺中产生功能蛋白，可以作为胶原蛋白或其他候选药物输送生物材料的有效、廉价的替代品。我们的研究结果表明，通过靶向P1A的表达，生物工程成功地生产出了具有重要应用潜力的生物有用性状的蚕。

参考文献：

关键词：