文| 逐梦古迹

编辑| 逐梦古迹

前言

层状双氢氧化物乳酸纳米片是将大分子输送到完整植物细胞中的强大载体。

【资料图】

近年来，对DNA/RNA转化和植物抗病性进行了一些研究，但很少有人关注LDH-lactate-NS合成和分层过程中的这些因素。

也没有研究它们与DNA吸附能力的关系或考虑植物细胞的转化效率。

今天，小梦就来为大家介绍，层状双氢氧化物乳酸纳米片，对拟南芥幼苗的生物学效应的影响。

不同温度下LDH-lactate-NS的制备与表征

用于制备 LDH-乳酸-NS 的复合和剥离步骤遵循 Wang先前描述的程序，我们对其稍作修改。

通过共沉淀 0.0375 mol Mg2 · 3H 2 O、0.0125 mol Al 3和0.0375 mol乳酸，通过加入4M NaOH使混合溶液的pH值保持在10，得到的LDH-乳酸盐-NS分散体的浓度为1g/L。

原料由Mg 2 ·3H组成2 O和Al3，这与LDH-lactate-NS中元素Mg和Al的量一致，在共沉淀反应的滴定过程中，我们发现在 0 °C 的冰水浴、15 °C 的低温和室温 25 °C。

合成和分层的 LDH-乳酸-NS 在 0°C、15°C 和 25°C 下表示为 LDH-乳酸-NS。通过 TEM 测量尺寸，并使用 Malvern 2000 zeta 电位分析仪测量分层 LDH-乳酸-NS 的 zeta 电位。

野生型拟南芥的种子在 68% EtOH 和 20% H 2 O 2中灭菌 5 分钟，然后在半强度 Murashige 和Skoog培养基补充有 1% 蔗糖。

平板在 20–22 °C 的长日照条件下生长，无菌培养皿用于所有发芽和生长实验，将已灭菌的拟南芥种子置于不含或含 LDH-乳酸-NS和 RM的 MS 上进行发芽和生长。

烟草品种，亮黄色2细胞在含有 0.43%MS、1 mg/L 硫胺素、0.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸 、100 mg 的液体培养基中培养/L 肌醇、200 mg/L KH 2 PO 4和 3%蔗糖。

它们被放置在 130 rpm 的定轨摇床上，在 26 °C 的黑暗中生长，培养 3-4 天后，将细胞用于以下实验。

本实验在室温下完成，实验方法参照前人研究，在电场的作用下，带负电荷的DNA分子向正极移动。

因此，如果在固体凝胶中加入Gold View染料，则电泳时可观察DNA在凝胶中的迁移率，并可通过ImageJ软件进行灰度分析。

LDH-lactate-NS吸附DNA分子后，生成的LDH-DNA分子呈电中性，留在位点孔隙中，不发生电泳迁移。

将 10 μL DNA 溶液与一定量的 LDH-lactate-NS 原液混合，使最终质量比为 1:1、1:2、 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9 和 1:10。

将混合物涡旋 10 分钟，然后添加到 0.8%琼脂糖凝胶的每个孔中。电压设置为 140 V，电泳 10 分钟后，凝胶用 Gold View染色，并使用 UV 照明器成像。

仅含 DNA 溶液的样品用作对照，为了探索接触时间对 LDH-NS 吸附 DNA 的影响，使用了 1、5、10、20、30 和 60 分钟的各种吸附时间。

对于每个测试，将 20 μL LDH-acetate-NS添加到 50 μL DNA 溶液中，达到 1:0.4的最终质量比。

以 14,000 rpm 离心 10 分钟后，用 100 nm 孔径膜过滤混合物，上清液中剩余的 DNA 通过 260 nm 的紫外-可见分光光度法测定。

为了在各种实验重复中标准化实验，我们使用每个培养皿 20 个样本，每个处理使用 5 个培养皿。

测量了至少 30 个生长在不同平板上的根，确定平均伸长率和直径，以及它们的标准偏差。

共聚焦激光扫描显微镜观察

在与 LDH-lactate-NS 孵育后，将 10 μL 分散良好的 BY-2 细胞滴到载玻片上，并用倒置激光扫描显微镜捕获荧光。

其参数基于先前研究的参数，PIN2pro:PIN2-GFP和DR5pro:GFP获自 Rujin Chen，并在含有1、10、100的固体培养基中培养 5 天, 300 μg/mL LDH 或 1, 10, 100 μg/mL RM。

然后，在激光扫描共聚焦显微镜系统下观察这些幼苗，并使用 ImageJ 软件进行分析，参数如前所述。

用 488 nm 激光激发绿色荧光蛋白和 FITC 荧光，并在 500 和 550 nm 之间的波长收集发射荧光。

用 0、1、10、100 和 300 μg/mL LDH-乳酸-NS 或 1、10 和 100 μg/mL RM 处理幼苗 5 天。然后，收获根组织并冷冻在液氮中。

由于缺乏活苗，我们决定不使用 300 μg/mL RM 进行实验，使用总 RNA 提取试剂盒 RN53提取总 RNA。

使用一步 gDNA 去除和 cDNA 合成 SuperMix进行逆转录，根据制造商的说明，使用 SYBR Green Mix在具有 ABI PRISM 7300 系统的光学 96 孔板中进行 PCR。

在每个反应中，使用 0.3 M 引物和 0 ng cDNA，四个生物学重复中的每一个的 PCR 一式三份进行。

初始变性时间为5分钟，随后是 40 个循环，95°C 20 秒，54°C 20 秒，72°C 20 秒，84°C 30 秒，72°C 10 分钟。

在 PCR 循环后运行熔解曲线，分析中使用了四个独立的生物学重复，如iCycler手册中所述，通过比较计数方法生成和分析实时PCR数据以获得每个组织的相对mRNA表达。

基于肌动蛋白和所有分析基因的相等扩增效率，选择肌动蛋白作为内部对照中所述，通过比较计数方法生成和分析实时PCR数据以获得每个组织的相对mRNA表达。

选择肌动蛋白作为内部对照，通过比较计数方法生成和分析实时PCR数据以获得每个组织的相对mRNA表达。

基于肌动蛋白和所有分析基因的相等扩增效率，选择肌动蛋白作为内部对照，qRT-PCR 中使用的引物。

为了确定拟南芥根部吲哚-3-乙酸流出和流入的实时通量，我们使用了非侵入性微测试技术幼苗用 0、1、10、100 和 300 μg/mL LDH-乳酸-NS 处理，然后在步骤“植物材料和生长条件”中描述的条件下垂直生长 5 天。

以相同浓度处理的种子从尖端到第一根的毛发长度相似，以确保相同的生长条件，测试溶液由 0.1 mM KCl、0.1 mM CaCl 2、0.1 mM MgCl 2、0.5 mM NaCl、0.3 mM MES 和 0.2 mM Na 2 SO 4组成，pH 4.0。

单个拟南芥选苗，用滤纸条和树脂块将其根固定在培养皿底部，露出根尖，将测试溶液加入培养皿中，在室温下浸入根部 20 分钟。

弃去试液，随后加入5ml新鲜试液，在显微镜下，在距根尖 0、200 μm、400 μm 和 600 μm 处发现根部待测位点，IAA 通量微型传感器最初放置在距根部检测位点约 10 μm 处表面。

每个位点测量 3 分钟，每组重复 5 次。IAA通量率数据由imFluxes V2.0软件直接读取，通量率单位为fmol cm -2 s -1，其中正值表示流出，负值表示流入。

液相色谱-质谱法

拟南芥的幼苗暴露于 0、1、10、100 和 300 μg/mL LDH 5 天，每个处理有 3 个生物学重复。生长 5 天后，用双面刀片切下根，用 ddH 2清洗O, 用镊子将其放入 2 mL Eppendorf管中。

每个 EP 管需要收集大约 300–400 个拟南芥根，总样品质量 > 0.3 g，接下来，将 1 mL 提取物添加到样品中，并将其研磨成匀浆。

最后定容至1mL，震荡10s以上，超声20min，-20℃冷冻1h以上。然后 12,000× g离心5424R 冷冻离心机离心 15 分钟，吸取 800 μL 上清液，真空浓缩至干，然后用 100 μL 初始流动相。

用 MX-S 涡旋振荡器振荡后，以 12,000 rpm 离心 5 分钟，吸取 80 μL 到玻璃衬里，然后在 - 20 °C 下储存以备下一步使用。

然后使用连接 Xevo TQ-S 微型串联四极杆质谱仪的ACQUITY UPLC I-Class进行分析。采用MassLynx4.1软件记录数据，采用SPSS 18.0软件分析差异显着性。

按照步骤“植物材料和生长条件”中的描述对种子进行消毒和种植”，然后置于具有相同浓度 LDH的平板上。

培养皿在 4°C 下放置 1 天，然后从冰箱中取出并置于光照下 3 小时。然后用铝箔覆盖培养皿并以垂直位置放置在光照培养箱中。

生长 3 天后，将平板旋转 90 度，然后每 4 小时拍摄照片以测量根尖的曲率，为了防止错误，每张照片使用相同的 3 种重复。

取下培养皿上的铝箔以便对培养皿进行拍照后，弃去培养皿，下一张照片使用新的培养皿。

在共沉淀反应的不同滴定温度下，可得到不同粒径、电荷性质和吸附容量的LDH-lactate-NS。

在 0 °C、15 °C 和 25 °C 下通过滴定反应合成和分层的 LDH-lactate-NS 的 TEM 图像分别如图1 A-C 所示 。

LDH-lactate-NS在0°C、15°C和25°C下的zeta电位分析表明zeta电位是单峰的，表明溶液中只存在一个带电粒子。

鉴于在 0 °C、15 °C 和 25 °C 下合成的 LDH-lactate-NS 的 zeta 电位分别为 17.4 mV、30 mV 和 40.3 mV，我们有理由提出稳定性解决方案是 LDH_0 °C < LDH_15 °C < LDH_25 °C。

在 0 °C、15 °C 和 25 °C 下合成的 LDH-lactate-NS 的主要粒径分别为 38.2 nm 、42.6 nm 和 61.2 nm，分别。

在0℃、15℃和25℃的共沉淀反应滴定温度范围内，LDH的粒径和溶液稳定性随着共沉淀反应滴定温度的升高而增加。在低温下，可以获得粒径较小、zeta电位较低的LDH-lactate-NS。

在不同温度下获得的 LDH-乳酸-NS 的表征和 DNA 吸附。在 0 °C、15 °C 和 25 °C 下获得的 LDH-乳酸-NS 的A – C TEM 图像。

D在 0 °C、15 °C 和 25 °C 下获得的 LDH-乳酸-NS 的 Zeta 分布数据。E在 0 °C、15 °C 和 25 °C 下合成的 LDH-乳酸-NS 的粒径分布。

F在不同温度下获得的 LDH-lactate-NS 对 DNA 的吸附，G DNA过饱和条件下不同温度下合成的LDH-acetate-NS的时间吸附曲线。

研究了在不同温度下获得的LDH-lactate-NS的DNA吸附行为，采用电泳分析法研究了DNA在LDH-lactate-NS上的吸附情况。

阳性对照为相同质量浓度的DNA溶液，吸附梯度为1:1~1:10与 DNA:LDH-乳酸-NS 的质量比。吸附30 min后进行凝胶电泳检测。

表示0℃滴定合成的LDH-lactate-NS上完全吸收的DNA质量比为DNA:LDH = 1:7，而15℃完全吸收的DNA质量比为DNA:LDH = 1 :5, 在 25 °C 时是 DNA:LDH = 1:4。

结果表明，在25℃下合成的LDH-lactate-NS在三种LDH-lactate-NS中具有最高的DNA吸附能力，滴定温度越高，吸附能力越强。

为了进一步研究接触时间对在不同共沉淀反应温度下获得的 LDH-乳酸-NS 吸附 DNA 的影响，我们在吸附中使用了 1、5、10、20、30 和 60 分钟的各种吸附时间实验。

表明随着接触时间的增加，DNA的吸附率逐渐增加，1分钟后，在0℃下得到的LDH-lactate-NS对DNA的吸附率仅为0.13%。

而在15℃和25℃下得到的LDH-lactate-NS对DNA的吸附率分别为13.21%和25.81% 。

5 min后，在0℃、15℃和25℃下得到的LDH-lactate-NS的DNA吸附率分别达到0.98%、16.43%和28.57%。60 min后，在0℃、15℃和25℃下得到的LDH-lactate-NS的DNA吸附率分别为13.56%、34.11%和44.24%。

5 分钟后，在 15 °C 和 25 °C 下合成的 LDH-lactate-NS 吸附了 DNA，而相比之下，在 0 °C 下获得的 LDH-lactate-NS 吸附了很少的 DNA。

总之，结果表明，随着吸附时间的增加，LDH-lactate-NS对DNA的吸附率逐渐增加。

LDH 将带负电荷的荧光染料输送到植物细胞中

在这项研究中，我们使用 BY-2 细胞作为模型系统来研究在不同温度下获得的 LDH-乳酸-NS 作为植物细胞分子载体的能力。

中性纳米血小板结合物 LDH-乳酸-NS-FITC 能够将膜不可渗透的带负电荷的荧光染料 FITC 穿梭到完整植物细胞的胞质溶胶中 10 分钟。

需要注意的是，在之前的研究中，LDH 是在室温下获得的。如图2B、C所示，15分钟后，单独的CK和LDH-lactate-NS溶液中没有荧光。

细胞壁外富集了大量带负电荷的FITC BY-2 细胞，呈弥散分布。

在培养基中加入LDH-lactate-NS-25℃+FITC的混合物，处理细胞15分钟后，带负电荷的FITC聚集在细胞核内。

结果表明，LDH-lactate-NS-25 °C 吸附 FITC，穿透 BY-2 细胞壁，并在 15 分钟内聚集在细胞核中，与其他两种材料相比，作用更快、更有效。

在不同温度下获得的 LDH-lactate-NS 将 FITC 递送到 BY-2 细胞中，BY-2 细胞的明场图像。B BY-2 细胞的荧光图像。

C具有三种 LDH-乳酸-NS 混合物的 BY-2 细胞的荧光图像，D BY-2 细胞与 FITC 的荧光图像，E含有 LDH-乳酸-NS-0 °C + FITC 的 BY-2 细胞的荧光图像。

F使用 LDH-乳酸-NS-15 °C + FITC 的 BY-2 细胞的荧光图像。G , H BY-2 细胞与 LDH-lactate-NS-25 °C + FITC 的荧光图像。

荧光显微镜采用蓝光激发，曝光200 ms，对比度1.0，伽玛1.99，增益3.7

为了了解在 25 °C 下获得的不同浓度的 LDH-乳酸-NS将如何影响根部细胞分裂，我们测量了有和没有 LDH-乳酸-NS 或含 RM，由 LDH-lactate-NS 的原料组成。

LDH-乳酸-NS 和 RM 均影响拟南芥种子发芽率，在 25 °C 的培养室中生长 3 天后，我们发现 LDH-lactate-NS 在 1–300 μg/mL 的浓度范围内不影响种子发芽率, 而 RM 在高浓度下强烈抑制种子萌发。

3 天后，用 100 μg/ml RM 处理的种子发芽率为 81.58%，4 天后为 94.64%。

基于LDH-lactate-NS不影响种子发芽率，而高浓度RM抑制种子发芽这一事实，我们推测LDH-lactate-NS和RM对种子发芽产生不同的生物学效应。

因此，我们测量了生长 5 天的拟南芥的根长，对于暴露于低浓度LDH-乳酸-NS 的根，观察到更适度的根长生长激活，而细胞生长显着增加观察到高剂量。

然后，在高浓度时略有下降，但仍高于野生型的生长。

相反，我们发现 RM 随着 1-300 μg/mL 浓度的降低而减少生长。

因此，向培养基中添加 LDH-lactate-NS 会导致根长增加，但添加 RM 会导致根长减少。

不同浓度LDH-lactate-NS和RM对拟南芥根系生长发育的影响。A用不同浓度的 LDH-乳酸-NS 和 RM 处理的拟南芥幼苗B根长。

从三个独立实验计算平均值和标准差，每个实验 20 株拟南芥幼苗，CK，控制检查。

LDH-lactate-NS影响根细胞相关基因的表达

基于之前的发现，我们认为 LDH-lactate-NS 可以影响许多对细胞功能至关重要的基因的表达。

为了验证这一假设，我们监测了在添加 1–300 μg/mL LDH-乳酸-NS或1 –100 μg/mL RM，以及在常规 MS 培养基中生长。

与CK相比， aux1和pin1的表达水平RM在1-100μg/mL范围内低于CK，相对表达水平随浓度增加而降低。

LDH-lactate-NS 中aux1和pin1基因的表达也有类似的趋势，值得注意的是，当使用 1 g/mL LDH 和 10 g/mL LDH 时。

aux1相对于 CK的表达水平分别为 3.07 ± 0.33 倍和 1.47 ± 0.20 倍， pin1相对于 CK 的表达水平为 1.90 ± 0.20 倍分别为 0.19 倍和 1.04 ± 0.07 倍。

结果表明，在低浓度LDH下，拟南芥根系中aux1和pin1的表达水平高于CK已经生长5天的幼苗。随着LDH浓度的增加， aux1和pin1基因的表达下降。

不同浓度LDH-lactate-NS和RM对拟南芥根系基因表达和定位的影响，LDH -lactate-NS 和 RM 影响了拟南芥 中的根基因表达。

B PIN2pro：通过共聚焦显微镜观察到的 PIN2-GFP 荧光。CK，控制检查。

所有植物实验条件独立重复三次，在这三个生物重复中的每一个中，至少制作了三个技术复制品。

在1μg/mL RM时，pin2的表达与CK相似，pin2的相对表达量随RM浓度的增加而增加，在 100 μg/mL RM 时，CK 的相对基因表达增加到 3.57 ± 0.23 倍。

与 CK 相比，1、10、100 和 300 μg/mL LDH 的 PIN2 基因表达分别为 1.39 ± 0.10 倍、1.23 ± 0.12 倍、1.26 ± 0.11 倍和 1.16 ± 0.15 倍。

结果表明，不同浓度LDH-lactate-NS处理的拟南芥幼苗根系中pin2基因相对表达量略高于CK，且pin2基因相对表达量随着LDH-的增加而降低。

乳酸-NS 浓度，无论是否添加LDH-乳酸-NS或RM， pin3的相对表达均高于CK，在具有不同浓度 LDH-lactate-NS 的根中，这些基因的表达与生长素运输有关。

因此，我们测量了生长素流量和生长素含量，结果表明，加入不同浓度的LDH-乳酸-NS后， PIN2pro:PIN2-GFP的分布没有变化，即使是在相当高的浓度。

为了确定促进根生长和改变对 CK 和 LDH-乳酸-NS的向地性反应的可能机制，我们进一步测量了根尖区域的体内生长素通量分布使用非侵入性微电极系统，这表明所有品系在根尖区域都有净根际生长素通量。

在 CK 和 LDH-乳酸-NS中，生长素流量峰值出现在距根尖 0.2 mm 处，CK和 1 μg/mL LDH 在距根尖 0.2 mm 处相似，而 10 μg/mL LDH、100 μg/mL LDH和300 μg/mL LDH显着增加。

结果表明，在距根尖 0.2 mm 处，IAA 的流速随着 LDH-乳酸-NS 的增加而增加，在距根尖 0.4 mm 处，CK 和 1 μg/mL LDH表现出相似的生长素流入。

相反，10 μg/mL LDH、100 μg/mL LDH和 300 μg/mL LDH表现出生长素流出。

100 μg/mL 和 300 μg/mL LDH 的生长素外排相似，高于 10 μg/mL LDH。距离根尖 0.6 mm 处的生长素流动趋势与 0.4 mm 处的相似。

根尖区域的生长素通量和生长素含量，A使用生长素特异性自参考微电极测量 5 日龄拟南芥幼苗完整根尖中的生长素通量分布。

B一个特定的离子电极检测进出样品的每个离子组分的流动信息。正通量值表示净生长素流入。值表示为平均值±SD。

C生长素含量的质谱图，值表示为平均值±标准差。

在用低浓度 LDH-乳酸-NS处理的根分生组织和过渡区中，生长素通量的趋势与 CK 的趋势一致。

在较高浓度下，生长素通量显示出显着的外排趋势，并且峰值随着 LDH-lactate-NS 浓度的增加而增加。

这些结果表明，LDH-lactate-NS 在分生组织皮层细胞中的向根定位对生长素运输产生负调节作用，并且随着 LDH-lactate-NS 浓度的增加，生长素通量降低。

为了定量和定性分析 LDH-lactate-NS 对拟南芥根部生长素含量的影响，我们使用超高效液相色谱-串联质谱分析植物激素。

质谱分析显示 CK 和 LDH-乳酸-NS中 IAA 的含量为 0.26 ± 0.05 ng/g、0.26 ± 0.03 ng/g , 0.36 ± 0.01 纳克/克, 0.48 ± 0.06 纳克/克, 和 0.39 ± 0.07 纳克/克, 分别。

拟南芥根中的生长素随着 LDH-lactate-NS 的添加而增加，在1-300 μg/mL范围内，拟南芥根部生长素含量随着LDH-lactate-NS浓度的增加而增加，当培养基中添加100 μg/mL LDH时增加最多。

与未剥离的 LDH 相比，带正电荷的分层单层 LDH 纳米片表现出更强的吸附 DNA 的能力。

LDH 纳米片 MgAl-lactate-NS 表现出比 MgAl-acetate-NS 高得多的 DNA 吸附能力，这表明 LDH 纳米片的吸附能力也与层间阴离子有关。

LDH 纳米片的吸附能力与结构和离子组成

然而，迄今为止，在LDH-lactate-NS合成和分层过程中，很少有人关注这些因素，也没有考虑它们与植物细胞DNA吸附能力或转化效率的关系。

在我们的调查中，我们发现共沉淀反应的温度可能是影响LDH-lactate-NS的zeta电位、粒径、DNA和RNA吸附能力以及植物细胞转化效率的关键因素之一。

与在0℃和15℃下获得的LDH-lactate-NS相比，在25℃下获得的LDH-lactate-NS具有更高的DNA吸附率和更高的DNA吸附效率。

表明在25 °C下获得的LDH-lactate-NS更稳定，具有更高的DNA吸附能力。

先前的研究表明，高电荷主体氢氧化物层与层间阴离子之间的强烈吸引力阻碍了进入层间空间AFM 结果表明。

将 LDHs 分层为单层是解决上述问题的一种方法，可以大大增加其表面积，从而实现对带负电荷的材料更强的吸附能力。

以往的研究表明，分层后主要得到单层原子，考虑到不同粒径代表不同的比表面积，在25℃下获得的LDH-lactate-NS的吸附能力越大，粒径越大。

LDH-lactate-NS 可用作悬浮 BY-2 细胞的纳米递送系统，延时视频显示细胞内 LDH-lactate-NS-FITC 信号在孵育 15 分钟后超过背景环境 FITC 信号。

在本研究中，孵育10 min后，25 ℃条件下获得的LDH-lactate-NS细胞内FITC信号可以被检测到，而其他的则不能。

此外，荧光显微镜显示，在 25℃ 下获得的 LDH-lactate-NS 可以轻松地将 FITC 递送至细胞核，这一结果与之前的研究相似。

这些结果表明，与在其他温度下获得的那些相比， 25 °C 下获得的 LDH-乳酸-NS 在吸收 FITC 和穿透细胞壁方面提供了更佳的性能。

这提供了强有力的证据表明在 25 °C 下获得的 LDH-乳酸-NS °C 可以作为悬浮 BY-2 细胞的高质量纳米递送系统。

我们还不能解释导致上述现象的确切机制。最可能的解释是，在较低的温度下，LDH-lactate-NS 的分层减少，并且几乎没有尺寸分布。

另一种不能排除的可能是，低温下得到的LDH-lactate-NS更不稳定，分层停止后，容易吸附溶液中的阴离子，导致形成分子量较大的多层LDH。

鉴于在 25 °C 下获得的 LDH-lactate-NS 表现出最佳的分层程度、最稳定的溶液、最高的 DNA 吸附效率和最高的转化效率。

我们得出结论，在 25 °C 下获得的 LDH-lactate-NS 是最适合植物学应用的 LDH-lactate-NS。

我们建议最适合植物学应用的 LDH-lactate-NS应在室温下合成和分层，以获得最高的 DNA 吸附率和负载能力，并且应具有 > 30 mV 的 zeta 电位，用于在溶液中保持出色的稳定性。

由于化学或物理作用，纳米材料可能对植物细胞产生毒性，因此，有必要研究纳米材料的毒性。

铝是地壳中含量最丰富的金属元素，游离铝离子是酸性土壤中抑制根系生长的主要因素。

在本研究中，我们发现由 Al 3+、Mg 2+和 C 3 H 5 O 3 −组成的 RM在溶液中抑制种子发芽率，抑制根伸长，并引起根尖的形态变化。

这些结果与之前关于高浓度 Al 3+抑制根系生长发育的研究结果一致，值得注意的是，在 1–300 μg/mL 的范围内，LDH-lactate-NS 不会抑制种子发芽率或导致根尖形态变化。

相反，向 MS 培养基中添加 LDH-lactate-NS 可显著促进根系生长，添加高浓度 300 μg/mL LDH-lactate-NS 导致的根伸长率低于 100 μg/mL 。

但仍高于 CK，而拟南芥在 300 μg/mL 时无法生长RM。

在 LDH-lactate-NS 处理下缺乏毒性的可能解释是中性 LDH-lactate-NS 在培养基中缓慢分解，释放的 Al 3+远少于RM。

另一种可能的解释是LDH-lactate-NS容易吸附阴离子形成中性离子，阳离子浓度低于RM。

因为对拟南芥的根有明显不同的生物学效应，我们推测细胞生长的增加与纳米材料的特性有关，而不是与 RM 相关。

以上结果引起了我们的好奇，促使我们研究为什么LDH-lactate-NS促进植物根系生长。

植物根的伸长与激素有关，主要是生长素。生长素主要通过极性转运产生的生长素浓度梯度来调节植物根系的发育，与顶端和基底质膜上的生长素输入载体AUXIN RESISTANT1和生长素输出载体PIN-formed蛋白有关。

因此，我们研究了与极性生长素转运、PIN 蛋白极性定位、生长素浓度和生长素通量相关的基因。

qRT-PCR结果显示， aux1、pin1、pin2和pin3基因的表达随着½ MS固体培养基中不同浓度LDH-lactate-NS的添加而不同。

拟南芥根pin2基因的表达随着LDH-lactate-NS浓度的增加而降低，人们普遍认为，PIN 极性是拟南芥分生组织中生长素转运的主要方向决定因素。

我们发现 LDH-lactate-NS 没有改变PIN2pro:PIN2-分布的潜在能力拟南芥根部的GFP。

值得注意的是，在高浓度的 LDH-lactate-NS 下， aux1和pin1基因的表达与低浓度的 RM 相似。

这表明铝的毒性特征与低浓度RM相似，我们怀疑在高浓度下，LDH在细胞内分解为Al 3+也会增加。

此外，根尖生长素通量的体内测量表明，距根尖的根尖过渡区是生长素极性通量最活跃的区域。

与 CK 相比，向培养基中添加 LDH-lactate-NS 显着提高了 10、100 和 300 μg/mL LDH-lactate-NS 根尖过渡区的生长素通量率峰值，其中1 μg/mL LDH-乳酸-NS 的响应不如 CK 显着。

考虑到加入LDH-lactate-NS并没有改变PIN2pro的分布：PIN2-GFP，我们假设生长素含量和生长素流量的变化，而不是生长素转运蛋白分布的变化，是植物生长变化的原因。

生长素含量和生长素流量的这种变化也导致了向地性的差异，这使得植物能够建立根系，其调节依赖于极性生长素运输。

此外，LDH-lactate-NS 的不同浓度梯度抑制拟南芥根向地性的事实可以支持这一假设。

结语

我们的研究结果表明，通过控制共沉淀反应的温度，可以合成和分层具有不同大小、电荷特性和 DNA 加载效率的 LDH-lactate-NS。

我们提出了生产最适合植物学应用的 LDH 的质量标准：在室温下合成和分层，zeta 电位 > 30 mV。

我们还确定了 LDH-lactate-NS 对植物细胞的毒性，我们发现在适当的浓度下，LDH-lactate-NS通过影响拟南芥对根系产生显著的积极作用。

生长素含量和生长素通量，而在相同浓度下，LDH-lactate-NS 强烈抑制拟南芥根的生长。

基于上述结果，我们假设纳米级 LDH-lactate-NS 降低了原材料的离子毒性，这为推进我们对纳米材料的植物毒性机制的理解提供了新的见解。

我们对上述结果的全面理解可以扩展到合成更优化的 LDH 纳米片作为 DNA 和 RNA 传输的载体。

还有可能使用 LDH 纳米片来促进植物生长，关于植物生物化学、营养、胁迫生理学和金属离子定位如何受植物细胞中 LDH-乳酸-NS 分解影响的一些基本问题仍有待回答。

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