文| 逐梦古迹

编辑| 逐梦古迹

前言

基于CRISPR-Cas9的多重基因组编辑是破坏植物基因功能的有效方法。

(相关资料图)

近年，CRISPR-Cas9的使用迅速增加，并且正在成为为生成单层和高层模拟南芥突变体的常规方法。

CRISPR / Cas9载体的低门槛、可靠组装和高效仿变是必须的，以使得研究人员能够最大限度地突破植物多基因家族内部的遗传者余，并允许进行以前无法实现的大量基础功能研究。

它还将允许在更复杂的遗传背后景象中常从头生成突变，这使得先存在的等位基因的基因渗入非常麻痹。

今天，小梦就来为大家介绍，荧光种子和多重基因组编辑，能快速组装生成多个拟南芥突变体。

多重CRISPR/Cas9的高效组系统

我们试图为植物研究领域设计一个高效且易于使用的 CRISPR/Cas9 系统。

这种系统的可能应用包但不限于： 在多个模拟南芥基因组位点同时进行确定向诱变；定向大缺失的产物； 通过引入新发现的Cas 蛋白、更有效的启动子来驱动Cas 表达或所需的选盒，一步修改基础于单站点联网的T-DNA载体。

因此，我们开发了一个系统，允许将多个 gRNA 可靠且常规地组装到已经包含Cas9的 T-DNA 目标载体中，组装方法结合了金门组装和基于单网关的重组。

组装需要三个步骤：第一步包括生成入门克隆，其中通过简单的寡核苷酸退火技术将 sgRNA 引入包含pU6或pU3启动子和 gRNA 支架的载体中。

这是一个单管反应，只需要退火的寡核苷酸对作为选择的 sgRNA 分子，将其引入方便的BbsI限制性位点。

我们选择寡核苷酸退火技术将 20 nt sgRNA 引入包含BbsI的入门克隆，基于其先前非常成功的应用。

这些 gRNA 入门克隆包含悬垂以实现一步金门组装，此克隆步骤依赖于BsaI，它属于 IIS 型限制酶家族，在其各自的识别序列之外进行切割。

我们将 Golden Gate 克隆方法的效率和多功能性与另一种允许序列独立克隆的方法，即单片段 Gateway 克隆相结合。

这种方法依赖于通过市售酶组 LR 克隆酶介导的 att 位点之间的重组。网关克隆用于许多领域，并且已经开发了广泛采用的载体集合。

Gateway 克隆已成功用于生成用于植物基因组编辑的多重 CRISPR-Cas9系统。

因此，本研究中生成的一组 Golden Gate 受体载体包含 ccdB 反选择盒，通过单个 Golden Gate 反应将其替换为 gRNA 表达盒。

Golden Gate 反应后，受体载体将包含所有 sgRNA，这些 sgRNA 与相应的pU6或pU3启动子组装在一起，两侧是 attL1 和 attL2 位点，用于最终的单个 Gateway LR 反应。

值得一提的是，我们没有使用双重、三重 LR 反应方案，因为我们手中的单一 Gateway LR 反应总是产生更多的菌落，因此在次优克隆条件下大大增加了成功的机会。

因此，我们决定设计所有带有 attR1 和 attR2 位点的最终 T-DNA 载体，以实现稳健性和高克隆效率。

在最终的 LR 反应中，所有 gRNA 盒在包含Cas9基因、驱动Cas9表达的启动子和所选荧光种子选择盒的 目标 T-DNA 载体中重组在一起。

CRISPR/Cas 克隆策略，a将选定的 gRNA 基于寡核苷酸退火克隆到包含pU6和pU3启动子的 pRU41-48 进入载体中。

b、c Golden Gate 将多达八个 gRNA 组装到相应的包含 attL1-attL2 的中间载体中，用于单个 Gateway LR 反应。

d最终单个 Gateway 组装成包含驱动Cas9的PcUBi4-2或pEC1.2启动子的 T-DNA 载体，载体包含三种荧光种子选择盒中的一种，即 FastRed、FastGreen 和 FastCyan

为此，我们构建了八个包含基于pU6或pU3的盒式磁带的 Golden Gate 进入载体和六个 Golden Gate 受体载体，用于测试最多八个 gRNA 的组装盒放入单个载体中。

我们发现通过 Golden Gate 组装所有八个 gRNA 盒很容易实现，并且 Golden Gate 组装成中间载体的效率通常在 70% 到 90% 之间。

单一 Gateway LR 产生的菌落为阳性

DNA 载体模块包含携带Cas9、zCas9i或Cas12a变体的质粒，这些变体以前曾用于高等植物。

它们是植物密码子优化的SpCas9 、 SaCas9 、 zCas9i和AsCas12a变体，不同 Cas 变体的表达由PcUBi4-2或pEC1.2启动子驱动。

与Cas9和内含子zCas9i不同，SaCas9和AsCas12a对 crRNA和 tracrRNA和先前开发的入门载体之间的相互作用有不同的要求138100可用于 gRNA 克隆。

pEn-Sa_Chimera 包含拟南芥pU6-26 启动子，后跟用于使用BbsI限制性位点和SaCas9特异性 tracrRNA克隆20 nt sgRNA 序列的间隔子。

该盒的两侧是 attL1-attL2 重组位点，可轻松一步将 Gateway 克隆到 pRU320、pRU321 和 pRU322 T-DNA 载体中，用于荧光种子选择。

为了克隆到包含AsCas12a 的载体中，由 Zhang 等人开发的 pYPQ133-STU-As 入门克隆。可以使用。

pYPQ133-STU-As 包含两侧为锤头和丁型肝炎病毒核酶的AsCas12a crRNA 支架，以及位于 HH 和 HDV 之间的 sgRNA 克隆位点。

这种含有不同 sgRNA 的盒式磁带可以使用BbsI限制位点亚克隆到 pRU41-pRU48 载体中，并用于克隆到中间载体中。

我们对多重 CRISPR/Cas9 T-DNA 载体的组装需要三个步骤，需要非常基本的分子生物学技术。

重要的是，PCR 不用于任何克隆步骤，这降低了 CRISPR/Cas9 组件内发生突变的可能性，并避免了控制测序的需要。

建立系统后，我们接下来测试了用于基因组编辑的载体系统，下面的工作主要集中在测试在pEC1.2或PcUBi4-2启动子下表达Cas9和 z Cas9i的载体。

颜色游戏——FastRed 和 FastGreen 向量的混合物，用于更快地筛选编辑事件

在每个携带Cas9盒的 T-DNA 载体中，我们引入了pOLE1 :: OLE1融合标记，带有 GFP 、tagRFP 或 mTurquoise2，以便能够简单地通过红色、绿色或青色荧光筛选种子使用荧光立体显微镜。

如前所述，FAST基于 OLE1翻译融合的表达，在其天然 pOLE1 启动子的控制下，从而在拟南芥发育中的种子的油体膜上积累荧光。

拟南芥种子积累了大量的油体，这些油体被细胞内嵌入蛋白质的磷脂膜包围。

油质蛋白是嵌入油体膜中的丰富结构蛋白，在调节油体大小和赋予种子抗冻性方面具有重要功能，在所有油质蛋白中，OLE1 在拟南芥种子中含量最高。

使用荧光种子选择的目的是减少以下时间长度： 鉴定 T1 中携带所需事件的转基因品系； 在T2代获得纯合的、无CAS9的突变体。

此外，我们决定测试携带 FastRed 或 FastGreen 的 T-DNA 构建体是否可以通过简单的基于农杆菌的共转化结合在一起。

在浸渍拟南芥花之前，我们将两种农杆菌混合将等比例的培养物混合成一种鸡尾酒。

在 T1 代中，我们能够筛选红色或绿色荧光种子，或同时筛选两种颜色，根据用户荧光立体显微镜中可用的滤光片组，可以通过在中间切换滤光片或使用绿色荧光长通滤光片来筛选两种颜色的种子来选择黄色种子。

在 T2 代中，我们注意到大约 70% 的独立双色种子系主要包含黄色种子，这表明尽管来自两个独立的载体和独立的细菌，含有 T-DNA 的 FastRed 和 FastGreen 盒通常进入一个共同的基因座并共同分离。

在 T2 中筛选非荧光种子使我们能够获得无Cas9的纯合突变体，我们以cuc1cuc2双突变体为例来演示我们的 FastRed 和 FastGreen 共转化系统的应用。

农杆菌介导转化后 T1 和 T2 代的荧光种子选择。在 T1 代中选择绿色、红色或黄色荧光种子，对编辑事件进行基因分型，并筛选 T2 后代的非荧光、无Cas9种子的稳定遗传突变。

两种策略同时靶向不同拟南芥基因座

首先，我们测试了我们的系统在拟南芥 CUC1和CUC2基因座中同时创建目标删除。 CUP -SHAPED COTYLEDON基因CUC1和CUC2编码芽分生组织启动所需的一对 NAC 转录因子。

它们在功能上是冗余的，每个单一突变体的幼苗几乎没有形态表型，而双突变体完全没有芽分生组织并产生完全融合的子叶。

为了增加获得不同突变等位基因和大缺失的机会，我们为每个选择了三个 sgRNA，CUC1和CUC2，位于不同外显子，沿编码序列分布，如克隆设置所示， 每个基因的三个 sgRNA 在pU6或pU3启动。

a CUC1和CUC2基因和 gRNA 位置的图形表示，b 分离的pEC1.2 :: Cas9和PcUBi4-2 :: Cas9系中的cuc1cuc2敲除子叶表型。

c所选 T2 品系的分离分析，对非荧光种子进行计数并评估非荧光种子中的cuc1cuc2表型是独立进行的。

d来自所选pEC1.2非荧光种子的 36 个野生型个体的分离分析：Cas9和PcUBi4-2 :: Cas9线。

黄色表示纯合子，绿色表示杂合子，灰色表示野生型个体，信号表示对于两个基因之一是纯合子而对于另一个基因是杂合子的个体。

e色谱图显示pEC1.2 :: Cas9和PcUBi4-2 :: Cas9系中通过测序鉴定的突变类型。

CUC1的 T-DNA 表达载体包含 FastRed， CUC2 的载体包含FastGreen 选择标记，为了比较效率，我们使用了包含驱动Cas9表达的pEC1.2或PcUBi4-2启动子的结构。

将 FastRed 和 FastGreen 构建体作为农杆菌混合物共同浸入野生型 Col-0 植物中，以产生具有单一或两种颜色的种子。

为了验证这些载体的稳定性，我们对转化农杆菌前后的所有元件进行了测序和验证。

在转化后的第一代中，我们使用荧光立体显微镜选择了包含两种颜色的荧光种子，将它们在平板上发芽并进行基因分型。

我们鉴定了杂合子和双等位基因 cuc1cuc2的双突变体，我们还在pEC1.2和PcUBi4-2实验中相应地确定了1/19和3/22嵌合植物。

尽管在PcUBi4-2 的共转化实验中事件的总数更高用于驱动Cas9，我们注意到当使用pEC1.2启动子时，在 T1 中发现了更多的双等位基因突变体。

这与之前的研究一致，其中pEC1.2被证明可以在 T1 中产生双等位基因和可遗传的事件。

正如预期的那样，cuc1cuc2双突变体表现出具有融合子叶的严重芽表型。

在我们手中，cuc1cuc2突变体无法存活，因此我们必须保持杂合的 T1 细胞系。

为了检查两个基因中检测到的突变是否从 T1 代稳定地传递到 T2 代，我们从pEC1.2 :: Cas9中提取了两个 T1 系。

从PcUBi4-2 :: Cas9中提取了四个系一个突变是杂合的，另一个是纯合的共浸渍实验，让它们自花授粉，选择非荧光种子并检查随后的T2代中的分离和突变类型。

由此产生的 T2 系分离，我们能够检测到显示双突变表型的高比例幼苗。

我们分选了两个T2系的36个非荧光种子，一个来自pEC1.2 :: Cas9 ，另一个来自PcUBi4-2 :: Cas9 共浸实验，更详细分离分析。

在pEC1.2 :: Cas9系的情况下，我们检测到 5/36 个个体具有一个CUC基因的杂合突变和另一个基因的纯合突变。

在PcUBi4-2 :: Cas9系的情况下，我们发现 23/36 个个体对于一个CUC基因是杂合的，而对于另一个基因是纯合的。

我们进一步验证了不存在在这些品系中使用Cas9特异性引物通过 PCR 进行Cas9。

因此，根据所有这些结果，我们的多重 CRISPR/Cas9 系统允许使用至少三个 sgRNA/基因和两个构建体的组合来同时靶向两个基因组位点。

这种策略还提供了筛选策略的灵活性，其中需要生成不同的突变体组合。

为了测试我们是否可以使用相同的构建体有效地靶向更多数量的 sgRNA，我们将三个用于CUC1的 sgRNA 和两个用于CUC2。

sgRNA克隆到携带Cas9在pEC1.2启动子下的同一载体中，生成的载体总共包含五个 gRNA 盒。

在 T1 中，我们可以获得双等位基因cuc1cuc216%；4/25 用于pEC1.2 :: Cas9和 14.3%；4/28 用于，杂合子与协同转化策略相比具有相似的比率。

这表明将至少五个 gRNA 堆叠到同一个载体中不会影响它们的效率。

在 T2 代中，我们能够识别出许多不含Cas9且携带不同类型突变的分离系。

使用共浸渍技术并将最多五个 gRNA 堆叠到一个载体中，我们获得的大部分是点突变，偶尔有大缺失和小的缺失或插入。

鉴于我们生成的载体具有 8 个 gRNA 的最大容量，使用共转化技术可以将数量翻倍至 16 个。这为生成高级拟南芥突变体提供了强大的工具。

此处描述的系统已成功应用于生成几个重要的高阶拟南芥突变体，突变体缺乏核心根内皮木栓质聚合机制。

nonuple 内皮层特异性漆酶lac1;3; 5;7;8;9;12;13;16突变体和四重myb41-myb53-myb92-myb93具有促进内胚层软木脂形成所必需的四种转录因子的突变。

在gelp quint的情况下，采用共浸渍策略，使用两种不同的 FastRed 和 Fastgreen 载体，它们总共包含 10 个 sgRNA，以靶向五个内皮层特异性 GELP 基因。

使用此策略，我们能够通过筛选来自 12 个不同 T2 品系的非荧光种子，有效地获得不同顺序的gelp突变体，包括两个不同的gelp quint等位基因。

虽然我们无法在gelp quint中检测到大的缺失使用两个 sgRNA/基因进行筛选，我们能够识别小事件，两个 sgRNA 之一或两者中的单核苷酸插入、缺失或少量核苷酸缺失。

这表明选择至少两个 sgRNA 来靶向一个基因会增加，成功进行基因编辑以及获得不同的多个突变等位基因的机会。

CRISPR/Cas T-DNA 载体

目前，新的Cas 蛋白及其修饰正在以很高的速度被发现和报道，其中一些比其他的更有效，具有不同的绑定属性和不同的 PAM 站点。

因此，我们决定修改我们的一些载体，以便能够快速轻松地交换启动子以驱动 Cas、Cas 本身和植物选择盒。

载体 pRU055 和 pRU319 具有位于启动子pEC1.2侧翼的KpnI限制性位点，以及位于Cas9序列和HindIII侧翼的SgsI或Asc I 位点荧光种子选择盒两侧的限制性位点。

所有这些限制站点允许在未来快速有效地替换所有三个元素，载体 pRU051、pRU052、pRU292、pRU293、pRU294 和 pRU295 允许轻松更换Cas9和选择盒。

例如，我们的载体可以通过用感兴趣的组织特异性启动子替换PcUBi4-2或pEC1.2来轻松修改以生成组织特异性 CRISPR。

用于进一步修饰和改进的 CRISPR/Cas T-DNA 载体，a T-DNA 载体的示意图，其中包含位于启动子、Cas 基因和选择盒两侧的KpnI、SgsI和HindIII限制性位点。

b基于种子特异性pOLE :: OLE1-mTurquoise2表达的 FastCyan 种子选择，黄色箭头表示阳性荧光种子。

c SGN3基因的示意图显示了所选 sgRNA 的位置，d分离的 T1 代双等位基因sgn3中基于木质素的 Casparian 条带的基本品红染色使用pEC1.2 :: Cas9和pEC1.2 :: zCas9i构造生成的突变体。

e pEC1.2 :: Cas9、pEC1.2 :: zCas9i、PcUBi4-2 :: Cas9和PcUBi4-2 :: zCas9i系中 T1 代的分离分析。

f pEC1.2 :: Cas9和pEC1.2 :: zCas9i系中 T2 代的分离分析。

为了展示我们的模块化克隆系统的优势，我们决定用最近发布的 Cas9 优化版本 zCas9i 替换目标向量 pEC1.2 :: SpCas9中的 Cas9，zCas9i包含13个内含子和z侧翼的两个 NLS 信号Cas9。据报道。

zCas9i可以显着提高主要 T1 转化体中的编辑效率。根据 Grützner 等人的说法，在pRPS5a下驱动的缺乏内含子的zCas9获得的初级转化体都没有启动子显示敲除突变表型。

而 70% 到 100% 的zCas9i生成的转化子显示突变表型，由于在我们手中，未修改的Cas9效率更高，未修改的Cas9会在多大程度上提高zCas9i的效率。

除了 z Cas9i之外，我们还用 FastGreen 和新生成的 FastCyan 替换了 FastRed 盒，以生成一组目标向量，其中包含在pEC1.2或PcUBi4-2下驱动的zCas9i，并结合 FastRed、FastGreen 或 FastCyan 荧光种子选择标记。

我们引入了基于 FastCyan 的荧光种子选择盒，不仅能够在红色和绿色光谱中，而且在天蓝色光谱中对种子进行分类。

为了测试这些新生成的质粒的效率，我们选择SGN3作为目标基因，SGN3编码一种受体样激酶，在维持 Casparian strip 的完整性方面具有重要功能，Casparian strip 是根内皮层中基于木质素的屏障。

在没有 SGN3 的情况下，使用碱性品红染色可以很容易地观察到木质素的不连续斑块。

为了比较，我们将三个 sgRNA 引入到包含 z Cas9i和缺少内含子的Cas9 的载体中以 SGN3 为目标。

在这两种情况下，Cas9或 z Cas9i都是在PcUBi4-2或pEC1.2启动子下驱动的，在 T1 代中，我们评估了sgn3的数量不同品系中出现的敲除表型。

我们观察到，在pEC1.2启动子下使用含有内含子的zCas9i生成的 T1 系显示了最高数量的敲除表型。

相比之下，相同的启动子驱动常规的，无内含子的Cas9，产生 30%的基因敲除表型展示个体。

尽管在无处不在的PcUBi4-2启动子下驱动的zCas9i在 T1 代中产生的敲除数量明显较低，但与驱动常规Cas9的相同启动子相比，它仍然更高。

为了检查敲除表型的遗传，我们生成了 T2 系并检查了每个构建体的两条系，pEC1.2 :: Cas9和pEC1.2 :: zCas9 i。

在所有四个品系中，我们可以通过选择无荧光、无 Cas9的种子来确认纯合sgn3表型。

这些结果表明zCas9i确实代表了对无内含子变体的显着改进，即使在无内含子Cas9显示出合理效率的系统中进行比较也是如此。

我们的数据表明pEC1 :: zCas9i这里报道的构造是一个高效的载体，用于生成已经在 T1 代中的双等位基因突变体。

在这项研究中，我们开发并测试了一个基于双色的多重 CRISPR/Cas9 工具箱，它由 Golden Gate 和 Gateway 兼容的载体组成，所有这些都可以在 Addgene获得。

这些载体允许组装多达八个gRNA，我们开发的 T-DNA 载体包含 FastRed、FastGreen 或 FastCyan 盒，它们通过避免生成非常大的结构来简化克隆策略。

简化了仅选择荧光种子的第一代以及选择Cas9 的第二代的筛选方法通过挑选非荧光种子来反选存在，然后检查所需的编辑事件，提供了在同一代中轻松筛选不同、更高阶突变体的能力。

为了演示多重分析，我们同时在每个载体中克隆了三个独立的 gRNA，将它们一起共转化到拟南芥中，这是一种尚未探索的方法。

DNA 载体包含驱动Cas9 的pEC1.2或PcUBi4-2启动子，包含内含子的 z Cas9i、SaCas9或AsCas12a和选择的荧光种子选择盒——FastRed、FastGreen 或 FastCyan。

此外，我们生成的大多数载体都可以轻松修改，以便能够引入任何启动子、Cas 基因或感兴趣的选择盒。

虽然我们偶尔可以通过使用三个 sgRNA 靶向同一基因来获得大的缺失，但大多数检测到的突变要么是单核苷酸插入，要么是缺失。

然而，我们在这里已及通过生成五重gelp突变体的示例证明，通过增加 sgRNA 的数量，我们增加了选择更有效的 sgRNA 进行基因编辑和获得不同的多个突变等位基因的机会。

需要进一步研究 sgRNA 之间的距离如何影响获得更多大缺失的机会。

总之，我们相信这里介绍的工具箱将在植物研究和植物合成生物学中非常有用，因为它具有流线型、易于使用和高效的克隆和选择系统。

此外，它的模块化和灵活性将使研究人员能够在未来轻松地构建和改进系统。

植物生长与转化

在所有实验中，使用拟南芥Columbia生态型，幼苗在不添加蔗糖的固体半强度 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基上发芽。

选择CUC1 、CUC2 和SGN3基因作为 CRISPR/Cas9 靶向的靶标。

T1 和 T2 代的种子经过表面消毒，播种在平板上，在 4 °C 下培养 2 天进行分层，并在连续光照下于 22 °C 的生长室中垂直生长。

对 6 日龄幼苗进行表型分析。对于农杆菌-介导的转化后，开花植物的长角果被移除，并通过移液将携带相应 CRISPR 构建体的重悬农杆菌细胞溶液与蔗糖和 SILWETT直接应用于花蕾。

在共转化的情况下，将 FastRed 和 FastGreen 载体分别转化到农杆菌中，并在 28°C 的 5 ml 培养物中生长过夜。

将培养物以 4000 rpm 离心 10 分钟，将沉淀重悬于蔗糖和 Silwet L-77 溶液中，将重悬的 FastRed 和 FastGreen 颗粒等量混合，制成用于同时转化两种构建体的混合物。

用于生成所有载体的引物在附加文件1中指出， pChimera 用作生成 pRU41、pRU43、pRU45 和 pRU47 载体的模板。

pRU42、pRU44、pRU46 和 pRU48 是通过用pU3替换pU6启动子产生的，引入相应的BsaI位点以在所有入门克隆中生成兼容的突出端。

中间载体pSF463、pSF278、pSF464、pSF279、pSF280、pSF325是通过引入相应的Bsa产生的我将站点插入包含 ccdB 盒和侧翼 attL1 和 attL2 重组站点的 pDONR221，准备好进行单片段网关克隆。

使用 pDe-Cas9 作为模板生成最终的 T-DNA 载体，FastRed、FastGreen 和 FastCyan 选择盒从 pFRm43GW。

pFG7m34GW和UBQ :: NLS-mTurquoise2载体中扩增，并引入 pDe-Cas9 载体代替 PPT 选择使用HindIII目录号 限制位点。

不同的Cas9和Cas12a从载体 pDe-SaCas9、pYPQ220扩增变体以及zCas9i，并通过使用SgsI 限制性位点替换PcUBi4-2启动子载体引入不同的载体。

所选 sgRNA 的位点4，sgRNA 目标位点始终位于外显子中，第一个 sgRNA 靠近翻译起始位点。

使用 Leica MZ16FA 荧光立体显微镜筛选携带 FastGreen、FastRed 和 FastCyan 盒的 T1 植物的荧光种子，以及 T2 品系的非荧光种子。

用于不同颜色的滤镜DSR 用于 FastRed； FastGreen 的 GFP3 FastCyan 的 CFP； GFP2用于携带 FastRed 和 FastGreen 结构的黄色种子。

使用 CTAB 方法提取转基因 CRISPR T1 和非转基因 T2 植物的基因组 DNA，叶子和花用于提取DNA。

使用移液器吸头直接在 100 μl CTAB 缓冲液中压碎植物材料，并在 65 °C 下孵育 40 分钟。

加入 100 μl 氯仿/异戊醇，倒置混合并以最大速度离心 5 分钟。收集上相，与 50 μl 异丙醇混合并孵育过夜。

第二天，将样品以最大速度离心 10 分钟，弃去液体，干燥后，将沉淀重悬于 50 μl 水中，用于基因分型和测序的引物。

结语

ClearSee 适用的木质素基本品红染色如前所述进行，使用Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜获得碱性品红染色的sgn3突变体根的共聚焦图片。

碱性品红的激发和发射光谱分别为561 nm 和 570–650 nm。

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